补肾促排卵中药对DOR小鼠雄原核及早期胚胎去甲基化的影响及作用机制研究

Our previous studies have shown that the Nourishing Kidney Promoting Ovulation Decoction can regulate reproductive hormones , suppress granule cell apoptosis in ovarian and promote angiogenesis in ovarian. The Nourishing Kidney Promoting Ovulation Decoction can induce ovulation of mature follicles and promote the development of the corpus luteum. The Nourishing Kidney Promoting Ovulation Decoction applied in Decline in ovarian reserve(DOR) during menstrual ovulation period have a significant effect on preventing and delaying premature ovarian failure (POF) . Combined with the breakthrough of male pronuclear and early embryo demethylation research in mice , we used a established mouse model of Decline in ovarian reserve to explore the the effects of Nourishing Kidney Promoting Ovulation Chinese medicine on morphological, physiological indicators and pregnancy in model mice, to investigate the effects of Nourishing Kidney Promoting Ovulation Chinese medicine and active ingredients on male pronuclear and early embryonic demethylation and to study the specific mechanisms of this process. According to investigating the exact mechanism of the Nourishing Kidney Promoting Ovulation Decoction curing decline in ovarian reserve, our research will provide experimental evidence for clinical application in order to better guide clinical use of the Nourishing Kidney Promoting Ovulation ovulation chinese medicine.

本课题组前期的研究证明，补肾促排卵汤可以调节生殖激素，抑制卵巢颗粒细胞凋亡，促进卵巢血管生成，促排卵中药诱发成熟卵泡排卵及促进黄体发育。经间排卵期应用补肾促排卵汤干预卵巢储备功能下降（DOR）疗效显著，对预防、延缓卵巢早衰(POF)的发生具有非常积极的意义。课题组拟结合近几年小鼠雄原核及早期胚胎去甲基化研究取得的突破性进展，利用已经建立的卵巢储备功能下降小鼠模型，探讨补肾促排卵中药对卵巢储备功能下降小鼠形态、生理指标及妊娠率的影响，探讨补肾促排卵中药及有效成分对小鼠雄原核和早期胚胎去甲基化的影响，并对这一过程的具体机制进行研究，以进一步解释补肾促排卵汤治疗卵巢储备功能下降的确切机制，为补肾促排卵中药的临床应用提供实验证据，以便更好的指导补肾促排卵中药的临床使用。

本课题试图通过研究补肾促排卵中药及有效成分对小鼠雄原核和早期胚胎去甲基化的影响，初步探讨补肾促排卵汤治疗卵巢储备功能下降的作用机制。本课题通过体内实验比较补肾促排卵中药对小鼠体重，生殖激素E2、FSH、P，卵巢组织形态，颗粒细胞凋亡因子Bax、Bcl-2、Caspase-3表达，子宫内膜ER、PR、LIF、HOXA-10、子宫内膜整合素αvβ3 蛋白和mRNA 的表达差异，小鼠胚泡着床率和妊娠率的影响，研究中药有效成分姜黄素对DOR小鼠卵巢的保护作用；通过体外实验比较各组小鼠卵母细胞体外受精率、二细胞卵裂率和囊胚形成率，比较各组小鼠受精卵在PN2、PN5阶段甲基化和羟甲基化表达差异，通过RNA-seq检测各组小鼠颗粒细胞基因表达差异，检测FSH对下游信号分子PKA、PI3K、PKB/AKT、p38-MAPK及ERK1/2的表达影响；为了进一步探讨补肾促排卵汤治疗卵巢储备功能下降的确切机制，本课题进一步研究了补肾促排卵中药有效成份对对猪体外胚胎发育的影响，猪受精卵雄原核去甲基化的变化以及TET3在猪体外受精卵、孤雌胚和克隆胚发育过程中的作用，补肾促排卵中药有效成份金丝桃苷、淫羊藿苷对大鼠卵巢颗粒细胞CYP17、CYP19表达影响等研究内容。以上研究结果表明补肾促排卵中药可以升高小鼠血清E2、P、AMH水平,降低FSH水平,补肾促排卵中药可能不是通过促进小鼠雄原核和早期胚胎去甲基化，而是通过上调颗粒细胞凋亡抑制因子Bcl-2,下调凋亡促进因子Bax、CasPase-3和衰老蛋白P16蛋白的表达,下调SOD2, Catalase, 8-OhdG, 4-HNE and NTY的表达抑制颗粒细胞的凋亡，通过FSH-PKA-PI3K-AKT-FOXO1信号轴促进颗粒细胞的存活，同时促进CYP17、CYP19蛋白表达，进一步促进颗粒细胞增殖，通过调节子宫内膜组织ER、PR、LIF、HOXA10和整合素αvβ3 蛋白表达提高子宫内膜容受性，共同作用以提高DOR小鼠妊娠率。本课题初步解释了补肾促排卵中药治疗卵巢储备功能下降的作用机制，为今后进一步从信号转导通路，表观遗传修饰和线粒体功能改善三个层面深入解析补肾促排卵汤治疗卵巢功能下降的作用机制奠定了坚实的基础，为更好的指导补肾促排卵汤的临床使用提供了实验证据。