小剂量钆对抗心肌缺血再灌损伤的保护作用及药物靶点的研究

Cardiomyocyte apoptosis is an early and essential stage processed to further myocardial death during myocardial infarction and ischemia/reperfusion. Marked accumulation of arachidonic acid (AA) in the myocardium during cardiac ischemia/reperfusion induces myocyte apoptosis and cell death by an undefined mechanism. Our preliminary data suggested that gadolinium chloride at low concentration inhibited AA-induced Ca2+ accumulation and cardiomyocyte apoptosis, which has likely been mediated by lipid raft/death receptor pathway. This project intends to study the protection effect of low-dose gadolinium chloride 1) on normal cardiac myocytes treated with AA, and 2) on myocardial ischemia/reperfusion rats, to clarify the mechanism underlying the potential effects of low-dose gadolinium chloride against AA-induced cardiomyocyte apoptosis and myocardial ischemia/reperfusion from cellular model to animal model. This project featuring with the combination of study on the mechanism of drug action and pathological mechanism would help clarify the pathogenesis of cardiomyocyte apoptosis, and provide new ideas for prevention and treatment of such disease.

心肌细胞凋亡/坏死是心肌缺血、梗死、心肌病等主要病理病变，抑制和缓解细胞凋亡/坏死一直是对抗器官损伤的重要途径。已知花生四烯酸（arachidonic acid，AA）是多种刺激诱导膜磷脂分解的产物，参与多个信号通路激活和细胞功能调节，然而病理性刺激,如心肌缺血/缺血再灌则产生大量AA，进而直接参与心肌细胞凋亡过程。前期研究发现，氯化钆是AA强效拮抗剂，小剂量氯化钆可显著抑制AA诱导的心肌细胞内钙增高和心肌细胞凋亡的发生，并提示其作用机制可能是通过脂筏/死亡受体通路所介导。因此，本课题将在细胞和整体水平系统研究：1）小剂量钆是否抑制AA诱导的心肌细胞凋亡及其机制；2）AA如何参与心肌缺血再灌损伤过程，以及钆的对抗作用及其机制。从而，为心肌缺血/缺血再灌病理状态下大量AA释放提供潜在的新的拮抗药物，也为防治心肌梗死及其潜在新靶点研究提供理论基础和实验依据。

目的：心肌梗死 (Myocardial infarction, MI) 严重威胁人类健康，通过恢复缺血心肌血流治疗MI会导致缺血/再灌注 (Ischemia/reperfusion, I/R) 损伤。心肌细胞的凋亡和死亡是心肌缺血再灌注损伤的主要病理改变。前期研究表明小剂量三氯化钆可消除花生四烯酸 (arachidonic acid, AA) 引起的钙离子超载, 进而降低I/R时期心肌细胞的凋亡。本研究旨在探讨低剂量三氯化钆对心肌缺血再灌注损伤中细胞凋亡以及心肌梗死的保护作用，并探讨潜在机制。方法：（1）体外实验：分离乳鼠心室肌细胞，建立细胞缺氧复氧模型，研究三氯化钆对缺氧复氧损伤以及AA诱导的心肌损伤的保护作用。通过流式、Western blot、钙探针等方法检测细胞凋亡及凋亡信号通路（死亡受体通路和线粒体通路）相关蛋白表达和激活，及对钙信号的影响。通过质谱和紫外揭示AA和三氯化钆在近生理条件下是否可能生成新的配合物。（2）在体实验：建立异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）诱导的大鼠心肌损伤模型和左前降支结扎诱导的大鼠心肌缺血再灌注模型。缺血前尾静脉注射三氯化钆，结扎左前降支致缺血30 min，再灌注2小时。Evans blue-TTC法检测药物对两种模型大鼠心肌梗死面积的影响，检测血清中肌酸激酶同工酶MB (CK-MB)，心肌肌钙蛋白I (cTn-I)，乳酸脱氢酶 (LDH)，以及AA的释放。TUNEL染色、Western blot等方法检测大鼠心肌细胞凋亡及信号通路相关分子表达。 结果和结论：（1）在细胞模型中，三氯化钆显著抑制AA、ISO或缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡，减少缺氧复氧介导的心肌细胞中AA和线粒体细胞色素C的释放，有效抑制AA或缺氧复氧诱导的钙超载，抑制死亡受体相关蛋白在脂筏的聚集和激活。质谱和紫外的结果提示，AA和三氯化钆在近生理条件下，可能生成新的配合物，但具体生成物的结构目前无法推测。（2）在ISO诱导的大鼠心肌损伤和缺血再灌注模型中发现，小剂量三氯化钆明显改善大鼠心肌梗死面积，减少血清中心肌损伤标志物和AA的释放，同时抑制心肌细胞凋亡，减少死亡受体相关蛋白的表达以及线粒体细胞色素C的释放。由此可见，在多种心肌损伤模型中，小剂量三氯化钆都具有抑制心肌细胞凋亡，减轻心肌损伤的保护作用。