基于紫外激光解离-质谱的蛋白质多位点修饰分析新方法

It is still a big challenge to elucidate the dynamics of multi-sites proteins post-translational modifications (PTMs). The proteins PTMs analyses based on mass spectrometry (MS) are highly relied on the dissociation efficiency in tandem MS detection. This project will integrate ultraviolent laser, high resolution MS and proteomics PTMs analysis to significantly imporve the accuracy of dynamic multi-sites proteins PTMs analyses. This project will develop new methods of multisite protein modification analyses based on ultraviolent laser-mass spectrometry. We plan to introduce the ultraviolent laser into the dissociation HCD cell of high-resolution MS with high accuracy to achieved highly reliable proteins sequences identification and highly accurate multisite modifications assignment. We will systematically investigate the dissociation efficiency of ultraviolent laser dissociation on proteins with phosphorylation and glycosylation modifications, as well as the complementarity to conventional dissociation strategies. Then, the new ultraviolent laser dissociation strategy will be applied to elucidate the sequences and multisite modifications of important proteins such as antibody drugs and inhibitors target (EGFR), which will significantly promote the antitumor drugs development and quality control of China.

多位点动态修饰的存在对蛋白质翻译后修饰的高精度质谱分析提出了巨大的挑战。针对目前修饰蛋白质多位点修饰精确定位分析等方面存在的不足，本项目将集成物理新型高能紫外激光光源、高分辨质谱分析、修饰蛋白质组学交叉学科技术，发展修饰蛋白质多位点动态修饰分析新方法。项目拟将紫外激光与高分辨质谱仪高效偶联，实现修饰蛋白质和多肽高效紫外激光解离。通过得到更丰富的序列、修饰特征性碎片离子实现修饰蛋白质的高可信度序列鉴定和高精度多位点修饰定位。项目将系统考察紫外激光对磷酸化、糖基化等多种修饰多肽和蛋白质的解离规律、修饰定位精确度，以及与现有常规解离技术的互补性。进一步将所发展的修饰蛋白质分析新方法应用于重要多位点修饰蛋白质如抗体药物和小分子药物靶点的序列鉴定和多位点修饰高精度定位分析，为我国抗肿瘤药物的开发提供重要的技术和数据支持。

本项目主要研究内容为紫外激光解离-质谱创新仪器装置和方法的发展和在蛋白质动态修饰结构分析中的应用。项目研究团队将真空紫外激光器与高分辨质谱仪高效偶联，发展基于真空紫外激光解离-质谱的蛋白质表征新方法，实现修饰蛋白质高效紫外激光解离和高序列覆盖率、高精度修饰定位质谱表征；并将所发展的创新仪器装置和方法应用于蛋白质动态结构表征、靶蛋白-药物相互作用机制分析等方面。项目研究团队搭建了193 nm紫外激光解离-高分辨质谱系统（UVPD-HRMS），可对大分子量团簇、多肽和蛋白质等进行高效解离和组成结构表征；实现了复杂蛋白质样品规模化组学分析。多肽UVPD可产生a-、b-、c-、x-、y-、z-等多种类型碎片离子，显著提升了多肽测序的长度和可靠性；193 nm 激光单脉冲UVPD可在5 ns内快速激发蛋白骨架至高能态引起高效解离，位点解离效率和碎片离子产率与其局部结构密切相关，通过碎片离子和位点解离效率分析可同时获取蛋白质序列、修饰和高级结构信息；搭建了世界首个极紫外自由电子激光-质谱实验装置（XUPD-MS），已纳入中科院大科学设施统一管理；目前已与中科院药物所、南方科技大学、浙江大学、浙江海正、深圳迈瑞等科研机构和生物医药公司开展合作研究，解决蛋白质动态组成结构表征和靶蛋白药物识别调控机制解析中的关键科学问题；采用< 200 nm高能紫外激光进行蛋白质的光化学修饰；由于水溶液对193 nm光子吸收弱，其高单光子能量可直接对水溶液中常规紫外光惰性物质Cl−、Br−和 I−高效激发，诱发自由基反应实现蛋白质原位氧化或卤化修饰。控制纳秒单脉冲激发有效降低了对蛋白质的光损伤；为蛋白质原位光化学修饰和结构-功能研究提供了一种全新的光化学手段，显著拓展了蛋白质光化学修饰的反应路径和应用范围。目前项目已发表通讯作者论文19篇，包括CCS Chemistry 1篇；Science Bulletin 1篇；Chemical Science 1篇，Analytical Chemistry 4篇，Trends in Analytical Chemistry 1篇，Journal of Physical Chemistry Letters 1篇，Chemical Communications 2篇；Chemosphere 1篇，相关工作完成了项目预定目标。