线粒体内膜融合蛋白OPA1分子伴侣活性研究

Optic atrophy 1(OPA1) is a major regualtor of mammalian mitochondrial inner membrane fusion. Under some stimulation conditions, like mitochondrial dysfunction or heat shock, OPA1 can be cut by proteases including OMA1 and Yme1L to a soluble form (OPA1-S). OPA1 can also be oligomerization. All these phenomena lead us to hypothesize that OPA1-S may have chaperone activity. Our proliminary data demenstrate that OPA1-S has chaperone activity in vitro. This is a new finding about OPA1 function that has no related reports till now. In this project, we will study the molecular mechanism and cellular function of chaperone activity about OPA1. By in vitro analysis, we will check the protein structure changes of OPA1-S under differrent temperature or pH gradient; analyze the ability of OPA1-S for preventing agregation of seperated mitochondrial inter-membrane space(IMS) proteins induced by temperature and pH gradient; analyze the key point of OPA1-S chaperone activity. By in vivo analysis, we will detect the response of different forms of OPA1 on induced IMS protein stress in OPA1-KO, OMA1-KO and Yme1L-KO cells; screen the intracellular target proteins of chaperone activity of OPA1-S; analyze the effects of over-expression of differernt OPA1 mutant proteins. This project would investigate the chaperone activity of OPA1 in vitro and in vivo, which provides novel function of OPA1 in response to cell stress.

Optic atrophy 1 （OPA1）是的一个重要的线粒体内膜融合调控蛋白，热激等刺激下可被蛋白酶OMA1或Yme1L等切割为游离状态（OPA1-S），我们大胆推测OPA1-S可能具有分子伴侣活性并在预实验中得以证实，目前未见相关报道，是OPA1功能的新发现。本课题将分别从体外和体内角度系统分析其分子机制和细胞学功能。体外实验将分析OPA1-S高级结构与温度和pH梯度的对应关系；OPA1-S对温度或pH诱导膜间隙蛋白聚合作用的影响；不同截短型和点突变与分子伴侣活性的对应关系。体内实验主要分析OPA1，OMA1及Yme1L敲除细胞对膜间隙蛋白压力的效应；交联法结合免疫沉淀和质谱分析筛选体内OPA1分子伴侣活性作用的下游靶标；表达不同截短型及突变体后的变化情况。本课题将首次探索OPA1分子伴侣样活性这一全新发现，为OPA1突变相关疾病的病理研究和治疗提供理论基础，有潜在的重要应用价值。

线粒体是真核生物细胞非常重要的细胞器，调控了众多的代谢途径和信号通路。线粒体的稳定性事关细胞的生死存亡，受到诸多。线粒体蛋白的质量控制是线粒体稳定性调控的重要方面，是一种重要的线粒体反向信号通路。目前仍有许多问题没有阐明，尤其是线粒体膜间隙蛋白的质量控制和稳定性维持的机制尚未形成统一的理论认识。OPA1是调控线粒体内膜融合的重要基因，我们发现OPA1 具有分子伴侣活性，该活性对于线粒体膜间隙蛋白的质量控制和稳定性机制具有一定作用。我们前期发现敲除了OPA1基因的小鼠MEF细胞的膜间隙蛋白在较高的温度下更容易聚集，随后我们在此敲除细胞中过表达OPA1-s蛋白，发现蛋白聚集被一定程度的阻止，说明OPA1-s可以阻止IMS蛋白的聚集。然后我们在大肠杆菌中过表达OPA1-s，我们发现，在高温下，过表达了OPA1-s的细菌更容易存活。此外我们在体外纯化了OPA1-s蛋白，发现其可以保护Catalase蛋白的热变性及Lysozyme变性剂诱导变性。综上实验结果，我们证明了OPA1-s具有分子伴侣活性功能，在生理环境中，该功能可能对于膜间隙蛋白的稳定性具有重要作用，因此对于线粒体质量控制有一定的作用。OPA1蛋白的分子伴侣活性是我们首次发现的OPA1这一蛋白的新功能，从全新的角度认识OPA1基因的功能，为 OPA1突变相关疾病的病理研究和治疗提供理论基础。