致病疫霉线粒体单倍型检测方法和不同单倍型演化关系的研究

通过测定致病疫霉线粒体单倍型的多态性可以成功揭示该病菌的遗传变异及其群体演化关系。致病疫霉线粒体基因组的成功破译，为进一步研究致病疫霉线粒体基因组多态性奠定了基础，本项目在对致病疫霉4个线粒体单倍型（Ia,Ib,IIa和IIb）基因组序列多态性分析的基础上，拟在线粒体基因组中2个含有大片度插入/缺失的高变区两侧保守区，设计2个特异引物对，通过PCR扩增和琼脂糖电泳，检测2个高变区扩增子的长度多态性，基于其长度多态性，建立致病疫霉线粒体单倍型检测的新方法。通过该方法检测我国马铃薯和番茄主产区致病疫霉的线粒体单倍型结构，进而评价我国致病疫霉群体的组成与变异。同时，测定本项目确定的不同线粒体单倍型2个高变区扩增子的序列，以Phytophthora andina和P. ipomoeae为外群，构建系统发育树，推断不同线粒体单倍型间的演化关系，为研究致病疫霉线粒体基因组演化提供参考。

本项目在对4个致病疫霉线粒体单倍型（Ia，Ib，IIa和IIb）基因组序列多态性系统分析和对已存在的3种线粒体单倍型检测方法系统分析的基础上，提出了以PCR为基础建立致病疫霉线粒体单倍型快速检测方法的必要性和可行性，确定建立新方法的理论基础。本项目研究认为致病疫霉线粒体基因组中由大片段插入/缺失引起的2个高变区即HVRi和HVRii是确定其线粒体单倍型的基础数据依据。第一个高变区HVRi由长度为1885bp的插入/缺失引起，据此可用来确定1990年Carter等人限制性内切酶酶切线粒体基因组即RFLP方法确定的type I和type II。而第二个高变区HVRii是由36bp重复单元构成的长度变异，重复单元数目n=1,2,3。该区域的多态性被用于在type I和type II的基础上进一步确定致病疫霉的线粒体单倍型。在致病疫霉线粒体两个高变区分析的基础上，致病疫霉存在6种线粒体单倍型即I R1，I R2， I R3，II R1，II R2和II R3。本研究以23致病疫霉菌株为例，用实验的方法检测到了5种致病疫霉线粒体单倍型，未发现II R1。同时，在被测的23个代表性菌株也发现了以PCR-RFLP方法中6个type I型菌株由于P4产物第二个酶切位点识别序列中的碱基C突变为T而造成的错误鉴定。利用新建的PCR方法测定我国10个省、市、自治区共462株致病疫霉菌株的线粒体单倍型。其中，引起马铃薯晚疫病的致病疫霉菌株共计444株，共发现了5种线粒体基因型，仍未发现II R1；25株引起番茄晚疫病的致病疫霉仅发现1个单倍型即IR3。本项目建立的以PCR为基础致病疫霉线粒体单倍型检测新方法，具有简单、快速、准确和单倍型类型丰富等特点，可广泛用于致病疫霉群体结构、动态变化和演化研究。我们推断致病疫霉II型线粒体比较古老，通过大片段缺失而形成I型。