DNA甲基化介导的miR-106a-363表达激活及其促结直肠癌发生的作用与机制研究

It is well established that DNA methylation can repress gene expression by inhibiting transcription factor binding or chromatin remodeling. To our surprise, we observed that some genes, such as miR-106a-363 cluster, was up-regulated in tumor, but showed an increase in CpG methylation at the proximal promoter.. To investigate the mechanism underlying the DNA methylation-mediated gene re-expression, we scaned the promoter of miR-106a-363 and found two binding sites for CCCTC-binding factor (CTCF). CTCF is a highly conserved zinc finger protein implicated in transcriptional repression and insulation, which binds DNA in a methylation-sensitive manner. Based on these basis, we hypothesize that DNA methylation may active miR-106a-363 expression by inhibiting CTCF binding. In this project, we will firstly verify the hypothesis by using chromatin conformation capture (4C and 3C)、ChIP and EMSA analysis, then we explore the roles of the up-regulated miR-106a-363 play in tumorigenesis and progression of colorectal cancer. .Our study will help to unveil the mechanism of some genes activation by DNA methylation and shed a new sight on the function of DNA methylation: DNA methylation can not only repress gene expression, but also can activate gene expression under some cases. On the other hand, our study will provide a new a target for prevention and treatment for colorectal cancer through miR-106a-363 functional study.

DNA甲基化通常可以通过抑制转录相关蛋白结合或引发染色质重塑导致基因沉默。我们比较正常和结直肠癌组织甲基化谱时意外发现，一些基因如miR-106a-363簇启动子在肿瘤中高度甲基化，但其表达没有沉默反而激活。基于miR-106a-363启动子发现两个锌指蛋白CTCF的结合位点、CTCF同转录起始位点附近DNA结合能够产生转录抑制、而且这种结合能够被DNA甲基化逆转，推测miR-106a-363启动子甲基化可能通过抑制CTCF的结合激活其表达。本课题拟通过染色质免疫共沉淀、染色质构象捕获等手段验证这一假设，并进一步探讨miR-106a-363的表达激活在结直肠癌发生、发展中的作用。本研究一方面将揭示DNA甲基化调控基因表达新机制，即DNA甲基化不仅导致基因沉默，也能激活基因表达；另一方面通过miR-106a-363簇在结直肠癌发生发展的功能研究，为结直肠癌的预防和治疗提供理论基础和新靶点。

启动子DNA甲基化通常会导致基因沉默。本课题在比较了结直肠癌和癌旁转录组和甲基化谱后发现，部分基因如miR-106a-363、谷氨酸脱羧酶1（GAD1）的启动子在肿瘤中发生了特异性的甲基化，但转录水平却显著高于正常组织。为阐明DNA甲基化激活基因表达的分子机制，本课题紧紧围绕DNA甲基化激活miR-106a-363、GAD1等基因表达这一有“异常”现象，利用细胞基因打靶和染色质构象捕获（3C）等方法，研究DNA甲基化基因表达的机制；并进一步利用临床样本、细胞实验和动物实验深入研究了GAD1等基因高表达后在结直肠癌发生发展中的意义。本课题主要发现（1）DNA甲基化不总是意味着基因的沉默，在某些情况下可以激活基因的表达。而且这种DNA甲基化介导的基因转录激活是一类基因共有的调控方式。（2）进一步研究发现，GAD1， miR-106a-363等高表达能促进细胞的增殖和迁移。尤为重要的是，发现GAD1的高表达与肿瘤的缺氧具有较高相关性，从而提出：GAD1可能具有通过形成细胞表面离子通道调节肿瘤细胞内外pH，从而耐受缺氧导致的酸性环境，即通过GAD1的表达产生“酸抵抗”，过表达GAD1 能够增强化疗药物的敏感性，这对于进一步靶向GAD1抑制肿瘤和增强化疗效果均具有重要的意义。（3）发现成纤维生长因子2（FGF2）是新生血管生成的关键因子之一。低氧诱导产生的低氧诱导因子Hif1a和Hif2a共同激活c-myc的表达，从而形成c-Myc/Max复合物，抑制miR-15-16a的转录。FGF2是miR-15-16a的靶基因，因此低氧通过抑制miR-15-16a的转录促进了FGF2的表达。在此基础上，提出了低氧诱导肿瘤新生血管形成、进而促进浸润转移的新的信号传递通路。上述研究发表在Hepatology、Oncogene 等较高水平杂志，同时引起了领域内的高度关注。申请者先后收到了第五届世界基因治疗大会（Atlanta，USA，2015），第八届世界癌症大会(大连，中国，2015)的邀请，针对这一研究结果和观点作大会报告交流。