miR-299-5p/ER/Gli通路调控甲状腺乳头状癌侵袭转移的机制研究

The incidence of papillary thyroid carcinoma (PTC) is increasing faster than any other solid tumor in the world, invasion and metastasis is the main reason for poor prognosis. Our preparatory work took the lead in finding out significant low-expression of miR-299-5p in invasive PTC tissue samples. Besides, miR-299-5p was associated with estrogen level. Forced/inhibited expression of miR-299-5p suppressed/promoted PTC cell invasion and migration. Bioinformatics software prediction showed that estrogen receptor (ER) α and transcription factor Gli3 were the important targets of miR-299-5p. Expression levels of ERα and Gli3 were significantly higher in PTC tissues than in normal thyroid tissues and were inversely related to miR-299-5p expression. On this basis, this project aims to prove that miR-299-5p regulates ERα in ERα-positive PTC; or directly regulates Gli3 in ERα-negative PTC to inhibit the Hedgehog pathway and then suppress the invasion of PTC cell. It is the first study which combined the roles of miRNA、ER and Hedgehog pathway. These results will be useful for understanding the invasion suppressing mechanism of miR-299-5p and finding new therapeutic targets for treatment of PTC.

甲状腺乳头状癌（PTC）是世界范围内发病率增长最快的恶性肿瘤之一，侵袭转移是其预后不良的首要原因。申请者在前期工作中率先发现miR-299-5p在侵袭组PTC组织中显著低表达，其表达水平与体内雌激素水平相关。过表达/低表达miR-299-5p后，PTC细胞的侵袭转移能力减弱/增强。生物信息学软件预测ERα和Gli3是miR-299-5p的重要靶基因。ERα和Gli3在PTC中较癌旁正常组织中高表达并且与miR-299-5p的表达水平负相关。以这一新发现为切入点，我们将miR-299-5p是否靶向ERα或Gli3来抑制PTC细胞的侵袭转移作为核心研究内容，拟通过分子生物学功能实验和动物实验证实miR-299-5p在不同ERα表达状态下经过Hedgehog（Hh）信号通路对细胞侵袭的影响，首次将miRNA、ER和Hh信号通路联系起来，为PTC靶向治疗提供新的思路。

甲状腺乳头状癌（PTC）是世界范围内发病率增长最快的恶性肿瘤之一，侵袭转移是其预后不良的首要原因。申请者在前期工作中率先发现miR-299-5p在侵袭组PTC组织中显著低表达，其表达水平与性别及腺外侵犯相关。过表达miR-299-5p后，PTC细胞的侵袭转移能力减弱。生物信息学软件预测ERα和Gli3是miR-299-5p的重要靶基因。ERα和Gli3在PTC中较癌旁正常组织中高表达并且与miR-299-5p的表达水平负相关。本课题主要研究内容包括在ERα阳性PTC细胞中，miR-299-5p 通过靶向ERα影响Gli1蛋白的表达，抑制Hedgehog通路的激活，进而抑制PTC 细胞的侵袭转移；在ERα阴性PTC细胞中，miR-299-5p 则通过靶向Gli3，直接抑制Hedgehog通路的激活，抑制PTC 细胞的侵袭转移。本实验通过实时定量PCR、免疫组化以及western-blot等方法证实了miR-299-5p 在甲状腺癌组织及细胞系中的显著低表达以及ERα、Gli1及Gli3的差异表达，通过靶基因预测软件以及双荧光素酶报告基因实验证实miR-299-5p与ERα或Gli3存在靶向结合，通过细胞转染和RNA干扰技术构建miR-299-5p过表达细胞系，通过细胞迁移和侵袭实验检测不同miR-299-5p表达状态PTC细胞系迁移和侵袭情况，重复上述检测，证实miR-299-5p对靶基因表达的调控以及对细胞侵袭转移特性的影响。为进一步探讨miR-299-5p调控细胞侵袭转移的机制，本实验通过检测Hedgehog通路关键蛋白Gli1表达的变化，证实过表达miR-299-5p可以抑制GLI1蛋白的表达。挽救实验证实过表达ERα可以部分逆转miR-299-5p对GLI1蛋白表达的抑制作用，说明miR-299-5p抑制GLI1和的表达是通过调控ERα来实现的。进一步采用免疫共沉淀方法，证实ERα和Gli1之间存在相互作用。裸鼠成瘤实验亦证实miR-299-5p可以抑制肿瘤的生长。.综上所述，miR-299-5p可以靶向ERα或Gli3影响PTC的发生发展。本研究为完善PTC发病的分子生物学机理提供了可靠的理论基础，同时也为以miR-299-5p或ER及Hedgehog信号转导通路为靶点开发有效的抗癌药、推动转化医学研究提供了依据。