适合于跨脑区研究神经环路的超微结构特征的大面积超分辨定位成像技术

Neural circuits are the biological basic of emotion and memory. Advanced brain functions are fundamentally depended on neural circuits within a large size level, while the intricate information transmission in neural circuits is mediated by sub-synapse structure. However, current available neuroimaging methods can not provide simultaneously the required large size (over multiple brain regions) and ultrahigh spatial resolution (sub-synapse level). In order to reveal the structures and functions of neural circuits and thus obtain new neurobiological knowledge, it is necessarily important to develop new neuroimaging methods. In this proposal, basing on our previous studies in the field super-resolution optical microscopy, we aim to develop a new imaging method called large-area super-resolution localization microscopy, which is capable of imaging biological tissues at a size of centimeter scale, a resolution better than synaptic contacts, and an imaging time within two hours. Further, to explore the potentials of this new imaging method in studying the pathogenesis of neuropsychiatric diseases, we plan to study the signaling pathways underlying the pathophysiology and treatment of a famous depression model called chronic social defeat stress, which requires the mapping of ultra-structural features of neural circuits in multiple brain regions. This method is believed to have great benefits to the description of the neuroanatomical features and functions of neural circuits in the whole brain, and thus will be helpful for revealing the mechanisms on the constitution of brain emotion and memory neural circuits.

神经环路是情感与记忆的生物学基础。大脑高级功能依赖于多尺度水平的神经连接，而神经环路中的信号传递则由神经元上的突触介导。当前神经成像方法无法同时兼顾神经环路研究所需的跨脑区范围和亚突触分辨的需求。为能更好地从多尺度水平研究神经环路的结构与功能，获取新的神经生物学知识，急需发展新型神经成像方法。本项目拟在前期超分辨光学成像的工作基础上，发展大面积超分辨定位显微成像新方法，其样本面积可达平方厘米量级，空间分辨率可达亚突触水平，成像时间小于2小时。在此基础上，我们拟以长期社会击败应激小鼠抑郁症模型为对象，研究抑郁症发生发展中神经信号传递通路相关的亚突触结构的跨脑区结构分布特性及功能变化，展示大面积超分辨光学成像在解决情感和记忆障碍相关神经精神疾病的发生发展机制研究上的潜力。该技术将为在全脑范围内进行神经环路超微结构的可视化奠定基础，进而为情感与记忆相关神经环路结构与功能研究提供全新技术支撑。

发展大面积超分辨定位成像技术，用于高效快速获取跨脑区神经连接的超微结构信息，为神经信号传递通路的超微结构及其功能变化提供全新数据，无疑将为脑科学提供新的工具。针对发展大面积超分辨定位成像技术所必须的大视场超分辨定位成像技术，本项目进行了深入系统的研究。主要研究内容及结果如下：1）针对大视场超分辨定位成像技术所必需的sCMOS相机，我们研究了相机的成像不均匀性对超分辨定位成像的影响。结果表明，成像不均匀性对定位精度几乎没有影响。该研究消除了研究人员对sCMOS相机的成像不均匀性的顾虑，其结果发表在Physical Chemistry Chemical Physics。2）我们直接比较了典型弱光探测器Andor iXon 897 EMCCD和 Hamamatsu Flash 4.0V2 sCMOS的成像能力。研究表明，当单像素信号小于30光子时，EMCCD的成像性能优于sCMOS；当信号高于30光子时，sCMOS优于EMCCD。另外，当荧光分子的峰值光子数大于80光子时，sCMOS的单分子定位精度优于EMCCD。该研究为大视场荧光探测所需的探测器提供了选型依据。3）我们建立了一种后采集漂移校正新方法RCC。该方法具有良好的少信号量数据处理能力，具有优异的稳健性能。相比于已有方法，该方法能使小视场及微小结构样品获得更高的分辨率。研究成果发表在Optics Express。此外，我们还发展了实时漂移校正方法，降低了系统漂移对最终超分辨成像质量的影响，为长时程成像提供了技术保障。4）我们发展了一种基于各向异性的定位数据筛选方法。该方法借助于生物结构的各项异性特点，可以实现更好的定位数据筛选，在不增加实验负担的前提下，提高了超分辨定位成像的质量。研究结果发表在Journal of Biomedical Optics。5）我们提出了一种结合多模光纤和棱镜式TIRF照明的方法，实现了200um x 130um的大视场均匀照明，其光斑质量达到最新文献水平。我们还对GFP转基因小鼠脑片神经元进行了双色超分辨定位成像，可以清晰分辨100纳米以下的树突棘结构，其分辨率明显优于扫描共聚焦成像。本项目共发表项目标注SCI论文4篇，申请发明专利4项（含1项授权）。本研究为发展大视场大面积超分辨定位成像技术奠定了基础，有望为跨脑区神经连接的超微结构研究提供新的工具。