Cn调节剂RCAN1结构解析及其抗角膜排斥反应的实验研究

Because of low specificity and manifested side-effects, traditional immunosuppressants are far from satisfaction in the anti-rejection therapy after keratoplasty. In recent, the development of molecular structural analysis provides a new approach to design novel immunosuppressants. RCAN1, a calcineurin modulator, is capable to inhibit Cn-NFAT signaling pathway with high specificity and meanwhile maintain the other catalytic activity of calcineurin, which leads to less side-effects. However, the structure of RCAN1 is still an unanswered question which limits our knowledge about the detailed working mechanism of RCAN1 and the following development of new immunosurppressant. In our pilot study, we had made tremendous efforts to establish protein induction, purification and crystalization methods, as well as keratoplasty animal models, which had laid a solid foundation for further studies. By constructing and crystallizing CnA/CnB/MCIP1 trimer, we plan to analyze the structrue of RCAN1, investigate the mechanism of RCAN1 and develop a novel immunosurppressant which can be applied in the anti-rejection therapy after keratoplasty. The accomplishment of our research will create structrue-based immunosuppressant development and will surely generate great scientific and clinical benefits.

传统免疫抑制剂存在特异性差和副作用大等问题，仍不能作为抗角膜排斥的理想用药。近年来，分子结构解析技术的发展为开发新型免疫抑制剂提供了新途径。RCAN1是一种新型钙调磷酸酶（Cn，calcineurin）调节剂，与传统免疫药物不同，可特异性阻断Cn-NFAT免疫信号通路，同时保留Cn其他正常生理功能，极大降低副作用。然而，RCAN1的结构解析是一项尚未解决的重大科学问题，严重制约对其结构机制的阐释和选择有效结构开发新型免疫抑制剂。本课题前期初步建立RCAN1蛋白质纯化体系和探索其结晶条件，并建立抗角膜排斥效果评估体系，为本项目的完成奠定了重要基础。本项目拟通过构建CnA/CnB/RCAN1三聚体为途径，解析RCAN1的空间构造，并利用其有效作用结构设计出新型免疫抑制剂，验证其抗角膜排斥效果。本项目将开辟以结构解析为基础的眼科药物研发新领域，并有望开发出理想抗排斥药物，具有重大科研和临床价值。

传统免疫抑制剂因特异性差和副作用大等问题而不能作为抗角膜排斥的理想用药。分子结构解析技术在近几年为开发新型免疫抑制剂提供了新途径。其中，RCAN1是一种新型钙调磷酸酶调节剂，可特异性阻断Cn-NFAT免疫信号通路，同时保留钙调磷酸酶的其他正常生理功能，极大地降低副作用。但是关于RCAN1的结构解析及其相关免疫抑制剂的研发仍是一项尚未解决的重大科学问题。综上所述，本研究项目建立了RCAN1蛋白质纯化体系，并探索出其结晶条件。通过质粒转化技术、Miniprep技术和DNA测序技术初步完成了表达CnA/CnB蛋白的质粒的检测。并基于对蛋白质诱导条件的筛选和优化，得到了具有高纯度和高质量的CnA/CnB/RCAN1 三聚体蛋白。在构建CnA/CnB/RCAN1三聚体过程中，我们解析出RCAN1的空间构造，并以此设计出一种新型的免疫抑制剂。然后，在大鼠同种异体角膜移植的动物模型中，我们对该新型免疫抑制剂的有效浓度进行探索，并得到抗角膜免疫排斥反应最有效的药物浓度。接着，我们与临床常用抗角膜免疫排斥药物0.05% FK506滴眼液相比较，通过角膜植片的病理学分析，免疫组化和免疫荧光染色，以及对角膜和房水中炎症及免疫反应相关因子进行量化检测，充分验证了RCAN1新型免疫抑制剂抗角膜免疫排斥反应的有效性和优越性。综上所述，本项目开辟了以结构解析为基础的眼科药物研发新领域，有望为临床提供理想的新型抗排斥药物，具有重大科研和临床价值。