井冈霉素发酵过程调控及其影响机制的探索

井冈霉素是迄今为止国内使用面积最广的一种农用抗生素，对其发酵过程深入研究具有重要的理论和应用价值。基于本研究室前期探索，在考察和综合优化主要环境影响因子的基础上，确立影响吸水链霉菌产井冈霉素发酵的关键环境因子。同时从完善井冈霉素生物合成途径酶基因的实时荧光定量PCR检测方法入手，结合二维蛋白电泳、色谱和质谱等先进手段，进行基因转录、蛋白质组和代谢物谱的分析，探索关键环境因子对吸水链霉菌发酵生产井冈霉素影响的内在作用机制，发掘与井冈霉素生物合成相关的基因和蛋白及其在环境变化时所作出的响应。基于获得的组学等信息，提出高效发酵生产井冈霉素的新方法新思路，并在生物反应器中实施和完善高效发酵策略。预期该研究不仅有助于深入了解影响和调节井冈霉素合成的机制，而且有关研究方法和思路将给其它发酵体系产次级代谢物的研究提供良好借鉴。

井冈霉素又名有效霉素A，是我国及东南亚地区应用最广的防治真菌病害的农用抗生素之一，对水稻纹枯病的防治效果最佳。通过环境因子筛选得到对发酵有促进作用的重要因子对工业化生产提高产量降低生产成本具有重要参考价值。在吸水链霉菌5008发酵生产井冈霉素的过程中受到一系列环境因子的影响，在细胞内产生多层面的响应与应激，从而影响到次级代谢物井冈霉素的产量和产素效率。本研究从影响井冈霉素发酵的环境因子筛选入手，筛选到乙醇、氨基酸、γ-丁内酯和脲等多个对井冈霉素生产有促进作用的因素。详细考察了温度、氨基酸、乙醇、携氧剂存在下吸水链霉菌5008的基因、蛋白、酶活和代谢物差异，对调控井冈霉素积累的方式进行了考察。以乙醇影响下的井冈霉素的发酵为例，通过乙醇添加使井冈霉素产量提高至约20 g/l，增产近60 %。在小型生物反应器（3 L）内实施可以提高产量25 %，进一步优化发酵条件后产量还有上升的空间。确立了通过乙醇添加促进井冈霉素增产的最优添加策略，为醇类添加提高其它抗生素产量提供了借鉴。发酵对数期添加微量乙醇，使产素效率得到大幅提高，而且细胞发酵后期自溶变慢。研究发现乙醇处理后对数期样品结构基因valABC、valKLMN、valG和全局调控基因afsR、glnR转录水平都迅速提高。afsR和glnR的调控都需蛋白激酶的介导，因此使用蛋白激酶抑制剂与乙醇同时添加，结果显示可使产量恢复到原始水平。外源乙醇添加后，也可观察到胞内乙醇浓度的提高和胞内活性氧信号分子的响应，同时伴随培养液颜色的加深。乙醇作为分子信号诱导胞内活性氧产生在微生物体系中尚无深入研究，特别是我们观察到乙醇与活性氧信号的相关性，为进一步以链霉菌为模型研究两种信号分子对次级代谢的调控机理和作用方式提供了重要信息。井冈霉素的合成与碳代谢密切相关，胞内磷酸戊糖途径的关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶和糖酵解途径的关键酶3-磷酸甘油醛脱氢酶都具有更高的酶活。可见，微量乙醇的添加还可以增强主代谢使井冈霉素获得更多的合成前体。加之前面提到由其引起胞内活性氧和全局调控因子的响应，调控胞内信号转导途径对其结构基因进行调节，结构基因的高表达也将带来井冈霉素产素效率的提高。本研究从信号转导、基因转录、酶活力、蛋白表达、代谢物谱等角度揭示了环境因子影响下的井冈霉素合成效率提高的机制，其研究方法和思路在其它次级代谢物发酵调控研究中具有重要的参考价值。