北极海洋链霉菌基因组挖掘及其卤化物合成基因簇研究

There is great potential for exploring microbial resources in the polar regions, which are largely unknown and uninvestigated. Discovering new microbial natural products by utilizing advanced technologies is a cutting-edge topic in polar microbiology. Previously, we isolated Streptomyces sp. 604F from Arctic marine sediments, which showed promising antimicrobial activity. The strain contains a new halogenase gene potentially within an unknown gene cluster encoding a possibly new halometabolite as predicted. Therefore, two scientific questions are proposed to be addressed: what genetic potential of synthesizing secondary metabolites does this strain have, and what will the predicted halometabolite biosynthetic gene cluster and its product be. To answer these questions, we will discover all potential secondary metabolite biosynthetic gene clusters via genome sequencing and data mining. We will then identify the predicted halometabolite gene cluster in silico by comparing to the known halogenase gene and its surrounding sequences obtained previously. The halometabolte gene cluster identified will be cloned directly from the genome by using the newly modified TAR (transformation-associated recombination) cloning, and transferred into Streptomyces coelicolor through conjugation for heterologous expression. Halometabolites produced will be isolated and determined by HPLC, MS and NMR analysis. Investigation of Streptomyces genome and its halometabolites from Arctic marine sediments has not been reported yet. Hence, this is a pioneering study of great importance in promoting investigation and exploitation of microbial resources in the polar regions.

极地微生物资源潜力巨大，但尚未得到较好的认识与研究。利用新研究技术挖掘天然产物是极地微生物研究的前沿。我们从北极海洋沉积物中发现链霉菌Streptomyces sp. 604F具备较强抗菌活性和新的卤化酶，且预测该卤化酶处于一个未知的次级代谢产物合成基因簇中，可能合成新的卤化物。因此，本项目将解决两个问题：该菌株合成次级代谢产物的潜力如何；具备怎样的卤化物合成基因簇与产物。通过基因组测序与生物信息学分析，挖掘该菌株编码次级代谢产物的潜力，并借助已知卤化酶及其周边序列寻找卤化物合成基因簇。利用改造的TAR克隆方法从基因组中克隆该基因簇，在Streptomyces coelicolor中实现异源表达。卤化物将经HPLC、MS、NMR进行分离鉴定。目前尚未报道北极海洋沉积物链霉菌基因组及其卤化物相关研究，因此本项目具有开拓性意义，对探索并加快极地微生物产物资源的研究与利用极其重要。

极地微生物资源的勘探与挖掘是目前极地研究领域的重点之一，也是我国在两极战略部署的重点内容。极地微生物蕴藏新颖的遗传资源和产物资源，但尚未得到发现和利用。因此本项目以北极海洋放线菌Streptomyces sp. 604F为例，从基因组测序与数据挖掘入手，揭示该菌株的天然产物合成潜力，并利用先进的大片段克隆与异源表达技术，激活沉默的目标卤化物合成基因簇，从而最大程度地挖掘极地微生物蕴藏的天然产物合成潜力及其基因资源应用价值。通过本项目，成功获得北极海洋放线菌Streptomyces sp. 604F基因组完成图，并预测出多达25个以上的天然产物合成基因簇，具有合成聚酮、非核糖体多肽、短肽（例如lantipeptide，thiopeptide，bacteriocin）、聚酮和非核糖体多肽杂合、萜类、四氢嘧啶、嗜铁素等多种类型化合物的能力，且多数基因簇尚未研究，可能合成新颖的天然产物。而通过传统的化合物分离鉴定方法仅可获得其中两个基因簇的产物（Antimycin和Vulgamycin系列化合物），可见绝大多数基因簇处于沉默状态，在传统的化合物研究中往往得不到发现，需要利用包括克隆与异源表达在内的技术进行激活才可以获得产物。以含卤化酶的基因簇为例，利用Red/ET克隆技术，直接从基因组中将长达83 kb的目标基因簇片段克隆到载体上，并在工程菌Streptomyces coelicolar M1154中实现异源表达。通过产物预测和基因簇分析，该卤化物与totpotensamides类化合物可能就有类似的骨架结构，即由6个氨基酸残基组成的肽和一个聚酮链杂合而成，且存在卤化修饰，该类化合物结构新颖、复杂，为化合物的分离鉴定带来了一定的困难，因此激活后的基因簇产物尚未鉴定完毕。..本项目首次对北极海洋放线菌进行了基因资源和产物资源的挖掘，揭示出极地微生物巨大的资源潜力，对于开展极地微生物资源勘探具有重要意义。通过本项目获得的Streptomyces sp. 604F基因组及其编码的多个基因簇，可以为今后开展新颖产物的激活与合成生物学研究奠定基础。本项目搭建了综合微生物学、天然产物化学、遗传工程等多学科方向的研究平台，为极地微生物天然产物研究技术与资源储备做出了贡献。