食线虫细菌吸引宿主的分子机制研究

作为一类重要的线虫病原微生物，食线虫细菌能有效地侵染捕杀线虫，是自然界中线虫虫口密度的控制因素之一。在我们前期对食线虫细菌（Bacillus nematocida strain B16）的研究工作中发现，该病原细菌可以通过分泌挥发性物质来强烈引诱线虫，从而成功实现对宿主侵染的第一步。但迄今为止，食线虫细菌引诱线虫进入其侵染范围的分子基础及其相关机制的研究还鲜有报道。因此，本项目将从线虫的趋化性入手，采用SPME固相微萃取，GC-MS鉴定，纯品验证等手段，力求找到细菌吸引线虫的主要信号分子。在此基础上，对已知合成途径的信号物质根据文献报道直接克隆出关键基因；对未知的信号分子，则利用转座子构建食线虫细菌的随机突变文库，筛选吸引线虫能力降低、相应信号物质缺陷的突变子，然后通过反向PCR技术，克隆出调控信号分子合成相关的基因，从分子层面上探索食线虫细菌与线虫在吸引过程中的相互作用机制。

我们前期对食线虫细菌（Bacillus nematocida B16 strain）的研究工作发现，该病原细菌可以通过分泌挥发性物质来强烈引诱线虫，从而成功实现对宿主侵染的第一步。在此基础上本研究对其产生的挥发性信号分子进行了鉴定和验证，确定了七种引诱线虫的信号分子，包括苯甲醛，苯甲酸苄酯，苯乙酮，2-庚酮，吲哚，萘和2，5-二甲基茴香醚。进而通过敲除在革兰氏阳性细菌中重要的群体感应系统基因comP,发现该突变株吸引线虫活性显著下降，且利用GC-MS检测研究前期鉴定的挥发性信号分子2-庚酮消失，从而进一步证实2-庚酮是B. nematocida B16菌株中吸引线虫的重要信号分子。围绕信号物质2-庚酮合成途径中关键基因进行了研究。根据野生型番茄Lycopersicon hirsutum f glabratum (accession PI126449)中发现有两种甲基酮合成酶MKS1和MKS2[The Plant Cell, 2005,17:1252–1267; Plant Physiology, 2009, 151: 1952–1964]，通过生物信息学的方法在食线虫芽孢杆菌B. nematocida B16菌株中鉴定了mks1和mks2的同源候选基因ynep和ytpA，并在大肠杆菌中的异源表达h后最终确定功能完全未知的假象蛋白yneP是B. nematocida B16菌株中主要的甲基酮合成酶基因，从而揭示出吸引线虫的重要信号分子2-庚酮合成的关键酶及其可能的合成途径。该研究内容已经正式发表SCI论文2篇，另有1篇SCI论文仍在投稿中。2010年获得云南省自然科学一等奖1项。主要从事该研究方向的博士生牛秋红所撰写的博士毕业论文《致病细菌Bacillus nematocida B16引诱并杀死线虫的新机制》获得2010年“云南省优秀博士学位论文”和2011年“全国百篇优秀博士学位论文”提名奖。