韧带丝状蛋白质的结构与性质及其常温常压调控纯文石形成机理

Natural silk liked proteins and nacre have been hot research objects in the fields of biomaterials and biomineralization due to their excellent mechanical performance. However, it is very difficult to reveal the formation mechanism of biogenic aragonite with nacre as research object, because nacre proteins are complicated. In 2009, we discovered a new type of silk liked protein in bivalve ligaments. This protein, which has excellent elasticity, tensile strength, and solvent resistance property, can modulate pure aragonite formation via transformation of amorphous calcium carbonate (ACC) without any additive at ambient condition. Therefore, it is a perfect research object for studying the formation mechanism of biogenic aragonite. In-depth study of the protein will provide a new template and theoretical basis for biomimetic synthesis of high performance materials. In this project, we aim to: 1) determine the primary structure of ligament silk liked protein by gene cloning method; 2) study the secondary structure of the protein and establish structural model using prediction software, assisted by solid state nuclear magnetic resonance determination; 3) analyze the structure of the protein and reveal the relationship between protein structure and its elasticity, tensile strength, and solvent resistance property; 4) identify at least two matrix proteins of ligaments which are likely related to calcification process and bone formation; 5) carry out biomimetic mineralization experiments with these proteins as templates or additives and determine their calcium binding activity at different condition. With above experiments, we will answer the questions why the protein has excellent mechanism performance and can modulate pure aragonite formation. Our researches will also provide basis for understanding the biomineralization process.

天然来源的丝状蛋白质和贝壳珍珠层因具有优异的力学性能而一直是生物材料和生物矿化领域的研究热点。然而，珍珠层蛋白质种类复杂，以其为对象研究生物文石（CaCO3）形成机理难度较大。2009年我们在贝壳韧带中发现了一种新型丝状蛋白质。其具有良好的弹性、韧性和耐腐蚀性，并能在常温常压无添加物的情况下调控无定形碳酸钙（ACC）相变成纯文石。这为研究生物文石形成机理提供了理想的对象。深入研究这种蛋白质，可为高性能材料的仿生合成提供新的模板和理论基础。本项目拟采用基因克隆技术测定韧带丝状蛋白质的一级结构；利用结构预测软件，并辅以核磁共振技术对二级结构进行研究，建立二级结构模型；分析一、二级结构与弹性、韧性和耐腐蚀性之间的关系；鉴定至少两种可能与钙化过程及人骨骼形成相关的韧带基质蛋白；结合钙离子结合活性测定及不同条件下仿生矿化实验结果，初步阐明韧带蛋白质调控纯文石形成的机理，为理解生物矿化过程提供基础。

天然来源的丝状蛋白质因具有优异的力学性能和良好的生物组织相容性，而受到研究者的关注。研究发现，大竹蛏韧带中存在一种新型天然弹性丝状蛋白质。这种蛋白质具有良好的弹性、韧性和抗拉强度，并可能与韧带中纯文石的形成有关。为了解这种蛋白质的结构及其对文石形成的调控作用，我们采用基因克隆技术，研究丝状蛋白质的一级结构；利用结构预测软件，及核磁共振技术对二级结构进行研究；分析一、二级结构与弹性、韧性和耐腐蚀性之间的关系；对韧带基质蛋白进行分离纯化鉴定；通过钙离子结合测定及仿生矿化实验，探索韧带蛋白质调控纯文石形成的机理。.经过研究，获得了韧带丝状蛋白质的一级结构。采用SOPMA和Predict protein软件预测了丝状蛋白质的二级结构，结果α-螺旋（14.54%）、β-折叠（40.55%）和无规则卷曲（44.91%）；采用固体核磁共振技术，测定并计算得到蛋白质的二级结构单元比例：α-螺旋37.15%，β-折叠62.85%。运用I-TASSER和SWISS-MODEL，对丝状蛋白质的三级结构进行了预测，得到其三维结构。发现无规则卷曲和β-折叠结构所占比例较大。分析丝状蛋白质一级结构发现，这种蛋白质含S氨基酸较多，可以通过侧链形成二硫键，增强蛋白质的韧性和抗拉性能。酸性氨基酸比例达到20%，表明这种蛋白质对钙离子有结合作用。分析了二级结构与蛋白质弹性和韧性的关系，发现丝状蛋白质的β-折叠结构几乎覆盖整个氨基酸序列。这种结构特征使其具有良好的弹性、韧性和抗拉性能。发现丝状蛋白质具有结合钙离子功能。对韧带基质蛋白分离纯化鉴定，发现：原肌球蛋白、β-肌动蛋白和钙调蛋白这三种蛋白质。仿生矿化实验结果表明，韧带丝状蛋白质通过结合钙离子，诱导ACC形成，并对ACC有稳定作用，从而使ACC转变成文石晶核。而基质蛋白通过结合并转运钙离子，参与文石形成过程，从而控制文石形貌。.本研究首次获得了韧带丝状蛋白质的氨基酸序列，为下一步人工合成仿生材料奠定了基础。首次发现这种蛋白质对钙离子的结合作用，为今后其在促进骨折愈合方面的用途提供了基础。