酵母菌葡萄糖耐量因子对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖代谢的影响及机理

As the most bioactive form of chromium，glucose tolerance factor (GTF) play an important role in maintaining normal blood sugar level. The mechanism of GTF on glucose metabolism is not clear. In this study, the pure sample of GTF are prepared from the established method. The glucose metabolism of GTF, high-molecular-weight chromium-binding substance and chromium picolinate on insulin resistent 3T3-L1 adipocyte cell are determinded by GOD-GLU and MTT. The relationship between Chromium and its activity are analyzed. Furthermore, the mRNA expressions of marker genes(IR, IR-1 and GLUT-4) involved in the glucose metabolism are determined by qRT-PCR and their protein expression are determined by Western blot. At last, the regulation of Phosphotyrosine phosphatase(PTP) and Tyrosine Protein Kinase (TPK) during Tyr phosphorylation are intensively studited. The molecular mechanisms of GTF and its pathway in vitro cell are demonstrated from the above three levels.

酵母菌葡萄糖耐量因子（GTF）作为铬的最有效活性形式之一，对维持机体血糖的正常水平具有重要作用。受分离纯化技术以及菌体含量低所限，胰岛素通路下GTF对葡萄糖代谢作用及其机理的研究没有完全展开。 本研究通过已建立的膜过滤、制备型色谱的方法从高GTF酵母菌里批量制备GTF，研究GTF和不同铬制剂对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖代谢作用的影响，活性中心铬与葡萄糖代谢作用之间的关系；在此基础上，利用实时荧光定量PCR和蛋白印迹技术分析GTF和不同铬制剂对抵抗型脂肪胰岛素受体、受体底物-1及葡萄糖转运蛋白的mRNA及蛋白的表达和活性的影响、通过免疫组化技术观察细胞内胰岛素受体分布；通过酶连免疫反应等研究代谢过程中酪氨酸激酶等的活性变化规律。从糖代谢调控作用、胰岛素通路中相关的蛋白及基因表达影响以及受体磷酸化过程中参与酶的活性变化规律三个层面分析和互相印证，研究GTF对葡萄糖代谢的作用机理。

膳食补铬是预防和控制糖尿病及其并发症发生、发展的重要途径。作为生物活性铬，酵母源葡萄糖耐量因子以其高吸收、高活性受到广泛关注。本项目通过开展GTF对胰岛素抵抗型3T3-L1细胞的糖代谢的影响及机理研究，明确GTF与其他补铬制剂相比的作用优势及机理，为酵母源葡萄糖耐量因子在糖尿病保健食品的开发和应用提供理论支持。本研究对有机溶剂联合氨水提取GTF的方法和参数进行了优化，提高了GTF的提取效率，铬蛋白比提高了6倍。在此基础上利用分子筛进行了GTF的批量制备。利用HPLC-ICP-MS分析GTF的铬价态为三价铬，有且只有一种价态的铬存在。并利用紫外全波长扫描、氨基酸分析及核磁共振解析了GTF的组成；通过不同胰岛素抵抗细胞模型研究了GTF和不同铬制剂对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖代谢、脂代谢的影响。GTF的有效剂量为0.5-1.5μg/mL；当GTF超过3ug/ml时，细胞活力会显著受损，下降至80%的活性，；GTF达到5ug/ml时，细胞活力降至52%（P < 0.01）。GTF量效关系最佳作用时间为24h；相比于同等剂量的三氯化铬、吡啶酸铬，GTF促进细胞葡萄糖消耗的作用效果最显著。GTF与10-7mmol/L胰岛素可协同刺激细胞的葡萄糖代谢。罗格列酮、GTF、吡啶酸铬和三氯化铬分别可使细胞葡萄糖消耗量提高3.1倍、2.5倍、1.7倍和1.2倍。在此基础上，利用实时荧光定量PCR和蛋白印迹技术分析GTF和不同铬制剂对抵抗型脂肪胰岛素受体、受体底物-1及葡萄糖转运蛋白的mRNA及蛋白的表达和活性的影响，分析和研究GTF对葡萄糖代谢的作用机理。GTF主要通过影响IR、IRS-1的表达改善糖脂代谢。铬复合物和胰岛素之间存在显著性的协同促进作用。在胰岛素存在下，不同来源的铬对细胞中的胰岛素信号途径中的关键基因的表达有显著性提高，其中以GTF的影响较为显著。相比于GTF单独作用， GTF与胰岛素共同作用下，细胞中IR，IRS-1，IRS-2 与GLUT4可以提高分别为2.4，4.1，0.9和1.1倍。