丙型肝炎病毒缺陷基因组的复制及包装机制研究

Hepatitis C virus (HCV) infects human hepatocytes, causing chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. As a highly variable positive-sense RNA virus, HCV exists in infected patients in a form of quasispecies. Deletion mutations could occur within HCV RNA genome to produce defective viral genome (DVG). The mechanisms underlying the replication and packaging of DVG as well as the physiological significance are not completely understood, and thus need more investigation. Our preliminary results revealed the presence of hot deletion spots in DVGs derived from HCV patient sera, which leads to the loss of the envelope protein-encoding sequences. Interestingly, we found that the entire core protein-coding sequence is always maintained in the identified DVGs. In addition, we identified one unique DVG that contains a frame-shift deletion mutation. Remarkably, in vitro experiments suggested that HCVcc containing this frame-shift DVG is able to translate viral proteins and replicate the viral genome. Based on these preliminary results, we raised three questions: what cis effects does the core-coding sequence play in the packaging of DVGs? What are the molecular mechanisms underlying the hot deletion spots identified within DVGs? What novel mechanism does the frame-shift DVG utilize to translate and replicate? In this grant application, we propose to address these questions. Our study will not only help elucidate the novel mechanisms and physiological significances of HCV DVG biogenesis, but also enrich our knowledge of genetic variation and life cycle of RNA viruses.

丙肝病毒（HCV）感染人肝细胞，引起慢性肝炎、肝硬化和肝癌。HCV是一种高变异的正链RNA病毒，在患者体内以准种形式存在。HCV的RNA基因组可发生部分编码序列的删除突变，产生缺陷基因组（DVG）。DVG的复制、包装机制及生理意义尚不完全清楚，亟待研究。我们的前期工作发现：丙肝患者血清来源的DVG存在序列删除热点，导致包膜蛋白编码基因的丢失，但核心蛋白编码序列却保持完整。此外，我们发现一例读码框错位的DVG，体外实验表明这种读码框错位的DVG模式仍然可正常翻译和复制。通过这些前期研究，我们提出三个科学问题：核心蛋白在DVG基因组包装中发挥了什么样的顺式作用，DVG删除突变热点的发生机制是什么，读码框错位的DVG使用了什么全新的病毒翻译和复制机制。本项目将针对这些问题开展研究，其结果将有助于揭示HCV缺陷基因组发生的新机制和生理意义，丰富我们对RNA病毒遗传变异及其生命周期的认识。

丙肝病毒(HCV)感染人肝细胞，引起慢性肝炎、肝硬化和肝癌。HCV是一种高变异的正链RNA病毒，在患者体内以准种形式存在。HCV的RNA基因组可发生部分编码序列的删除突变，产生缺陷基因组(DVG)。DVG的复制、包装机制及生理意义尚不完全清楚，亟待研究。我们的前期工作发现，丙肝患者血清来源的DVG存在序列删除热点。本项目围绕HCV缺陷基因组DVG产生的分子机制及意义开展研究，取得如下研究成果。我们分析了患者血液中存在的、结构蛋白编码区中具有缺失的HCV DVG。41个HCV临床分离株中约30％含有DVG，DVG序列与患者的全长基因组高度同源。没有发现DVG存在与病毒滴度和丙氨酸氨基转移酶水平之间的相关性。DVG的测序分析显示存在缺失突变热点，分别位于E1 N端的上游的缺失热点和E2和NS2中存在的下游缺失热点。尽管核心蛋白C和NS2蛋白质对于HCV基因组复制都不是必须的，但是在DVG中核心蛋白和NS2的C末端蛋白酶结构域的编码序列总是完整的。机制研究表明，位于NS2蛋白酶结构域的紧邻上游的跨膜区段3(TMS3)，是NS2-NS3切割和DVG复制所必需的。此外，我们在核心结构域2编码区内发现了一个高度保守的二级结构(SL750)，该结构的破坏不影响HCV基因组的复制，但是显著降低了HCV病毒颗粒的组装，提示SL750很可能是HCV基因组包装信号。总之，我们对血清来源的HCV DVG的分析揭示了在病毒复制和组装中起重要作用的新的病毒顺式元件，对于深入理解HCV感染的分子机制及疫苗研发具有较好的科学意义。本项目共发表论文11篇，其中通讯或共同通讯作者文章9篇。本项目执行期间共培养博士研究生3名，硕士研究生1名。