恶性疟原虫外切酶体调控var基因表达的机制研究

Var multigene family is the major virulence factor associated with antigenic variation and pathogenesis of Plasmodium falciparum, the most lethal pathogen of malaria which is still being one of the public threats of human health. Only one out of the 60 members could be expressed in this gene family,which points to the "mutually exclusive expression" system. The regulation process of var gene expression is believed to occur at transcriptional level by epigenetic factors including perinuclear localization, chromatin modification, non-coding sequences, etc. Recently, preliminary experiments with gene knock out strategy revealed that the Exosome-associated protein was involved in the transcriptional silencing of var genes, indicated the existence of post-transcriptional regulation pathway of var expression. However, the related mechanism is still unclear. In this study, we aim to systematically analyze the composition of P.falciparum Exosome complex (PfExosome) and its regulatory functions of var expression by techniques as transgene,co-immuno-precipitation,chromatin immuno-precipitaion,high resolution sequencing, etc. The accomplishment of this project will dramatically contribute to elucidation of variation mechanism of var gene family, and also provide new ideas and targets of defence against severe malaria.

疟疾仍是严重威胁人类健康的传染病之一，恶性疟原虫是其最致命的病原体。Var基因家族是其抗原变异和致病相关的关键毒力因子，约含60个成员，每个生活史只表达其中一个，即"相互排斥性"表达。现有观点认为，var基因的表达调控过程主要发生在转录水平：核周定位、染色质修饰、非编码序列等表观遗传学因素控制var基因启动子的转录状态。最近，我们通过基因敲除技术初步发现RNA外切酶体（Exosome）相关蛋白也参与var基因的转录沉默，提示var基因的表达还存在转录后水平的调控，即Exosome复合体介导的RNA降解途径，但是相关的机制尚不清楚。本课题拟利用多种转基因技术、免疫共沉淀、染色质免疫沉淀以及高通量的DNA/RNA深度测序等，对恶性疟原虫外切酶体(PfExosome)的组成和功能开展系统研究，为阐明恶性疟原虫var基因变异机制提供新的实验和理论依据，也将为恶性疟疾的防治提供新的思路和靶点。

疟疾仍是严重威胁人类健康的传染病之一，恶性疟原虫是其最致命的病原体。多拷贝变异基因家族（var）是其抗原变异和致病相关的关键毒力因子，每个生活史只表达其中一个，即“相互排斥性”表达。现有观点认为，var基因的表达主要受到染色质修饰等表观遗传学因素在转录水平上的调控，但是我们提出: 由RNA外切酶体（Exosome）参与的RNA降解机制可能是var基因表达的转录后调控新途径。为验证该假说，我们利用多种转基因技术、染色质免疫沉淀、荧光杂交以及高通量的核酸深度测序等，对恶性疟原虫外切酶体(PfExosome)的组成和功能开展了系统研究。研究表明：(1)PfExosome主要含有两个核心RNase催化酶(PfDis3和PfRrp6)，以及一个PfDis3相关蛋白（PfRNase II），它们皆具有3-5方向的单链RNA降解功能；（2）PfRNase II并不直接参与PfExosome复合物的RNA质控功能，而是主要调控恶性疟原虫抗原变异与致病相关的变异基因家族的表达，其中，A亚类var基因是其主要的靶基因。当PfRNase II基因缺陷后，几乎所有的A亚类PfEMP1表达于被感染红细胞表面，这完全打破了恶性疟原虫变异基因家族所具有的极为严谨的排他性表达模式；（3）ChIP和Nascent RNA等实验分析结果表明，PfRNase II通过与A亚类var基因上游序列相互作用，原位实时降解新生转录产物，由此调控A亚类var基因的表达，从而影响致死型的脑型疟发生。这项研究发现不仅是在国际上首次发现真核微生物具有由RNase酶介导的变异基因转录后表达调控途径，为真核微生物的抗原变异理论提供了新的实验依据，更为重要的是，将为导致每年全球近百万人死亡的重症疟疾提供了新的防治靶点和思路。