亚甲基蓝抑制水通道蛋白4表达减轻缺血性脑水肿的作用及机制研究

Ischemic brain edema is a common and serious complication of ischemic brain injury, but its treatment is very limited. Methylene blue (MB), as an alternative mitochondiral electron transfer carrier, has neuroprotection effect on brain. In the previous study, we found that MB can alleviate the brain edema induced by ischemia reperfusion injury in rat by MRI and transmission electron microscope for the first time. However, the mechanism remains unknown. Intensive research demonstrates that aquaporin 4 (AQP4) located in the plasma membrane of astrocyte plays a key role in brain edema. In our previous studies, using RNA interference technique, we found that AQP4 is a key molecule that mediates the swelling of AST caused by glutamate, and extracellular signal regulated kinase 1/2 (ERK1/2) signaling pathway is involved in the regulation of AQP4 expression after brain edema. Therefore, we speculate that MB alleviates ischemic brain edema by activating ERK1/2 signaling pathway to regulate AQP4 expression. In this study, we will explore the effect and possibility mechanism of AQP4 on MB alleviation of ischemic brain edema by MRI，histology, cytology, molecular biology in the model of rat ischemia-reperfusion injury and astrocyte swelling induced by glutamate, which will not only elucidate the molecular mechanisms of MB improvement of ischemic brain edema, but also provide an important experimental basis for the clinical application of MB treatment of cerebral edema.

缺血性脑水肿是缺血性脑损伤常见且严重的并发症，治疗手段非常有限。亚甲基蓝（MB）作为线粒体电子传递链替代物有脑保护作用。我们利用核磁和电镜技术首次证实MB能减轻大鼠缺血再灌注损伤所致脑水肿，但具体机制不清。有研究显示位于星形胶质细胞（AST）膜上水通道蛋白4（AQP4）在各种脑疾病所致脑水肿的发生发展中起重要作用，我们利用RNA干扰技术研究发现AQP4是介导谷氨酸引起AST肿胀的关键分子，细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）信号通路参与AST损伤后AQP4表达调节，因此我们推测MB通过激活ERK1/2信号通路调节AQP4表达进而减轻脑水肿。本研究拟采用大鼠缺血再灌注损伤模型及谷氨酸诱导AST肿胀模型，通过磁共振、组织学、细胞学、分子生物学等方法深入探讨AQP4在MB减轻缺血性脑水肿中的作用及机制，结果将阐明MB改善缺血性脑水肿的作用机制，也为临床应用MB治疗脑水肿提供重要实验依据。

脑水肿是缺血性脑损伤最常见的并发症之一，但其治疗手段十分有限。我们的前期研究发现亚甲基蓝（MB）能减轻大鼠缺血再灌注损伤所致脑水肿，但其作用机制不清。研究显示脑水肿主要是星形胶质细胞（AST）水肿，表达于AST膜上的水通道蛋白4（AQP4）在各种原因所致脑水肿中起重要作用。我们的前期研究也发现ERK1/2信号通路能调节AQP4表达。由此，我们推测，MB可能通过调节ERK1/2信号通路减少AQP4表达进而缓解缺血性脑水肿。首先在大鼠大脑缺血再灌注损伤模型中，我们发现，与模型组相比，MB组大鼠在缺血再灌注损伤1.5 h及47 h后相对ADC值（反映细胞性脑水肿）增加，说明MB能改善缺血所致细胞性脑水肿；其相对T2WI值（反映血管源性脑水肿）降低，说明MB能改善缺血所致血管源性脑水肿。同时，我们也发现，与损伤对侧比，给MB后，损伤侧缺血半暗带脑组织AQP4表达明显下降，说明MB有可能通过减少AQP4表达缓解脑缺血所致细胞及血管源性脑水肿。之后，在谷氨酸所致的AST肿胀模型中，我们发现10 μM的MB能减轻谷氨酸所致AST肿胀。同时，我们也发现，与模型组相比，10 μM的MB能显著降低谷氨酸诱导的AQP4表达增加，表明MB有可能通过降低AQP4表达减轻谷氨酸所致AST肿胀。接着，在动物模型中，我们观察到，MB能抑制缺血再灌注损伤48 h后，损伤侧缺血半暗带ERK1/2活化；在细胞肿胀模型中，我们也观察到，10 μM的MB能显著抑制谷氨酸所致ERK1/2信号通路激活，表明MB减轻脑水肿及AST肿胀可能是通过抑制ERK1/2信号通路完成的。最后，我们在谷氨酸诱导AST肿胀模型给予ERK1/2信号通路抑制剂（U0126）进行研究发现， U0126能显著抑制谷氨酸诱导的ERK1/2信号通路激活，给予MB能进一步抑制上述现象；U0126及MB均能抑制谷氨酸诱导的AST肿胀及AQP4表达上调，以上实验结果表明MB能减轻缺血性脑水肿及谷氨酸诱导的AST肿胀，MB的这种作用极可能是通过调节ERK1/2信号通路抑制AQP4表达上调实现的。亚甲基蓝作为一个世纪老药，在临床上被广泛用于治疗高铁血红蛋白血症等，我们的研究将为临床应用MB治疗脑水肿提供重要的实验依据。