PP2A调节亚基B56ε调控化学物诱导DNA损伤修复与细胞转化的研究

DNA修复缺陷在肿瘤发生发展中起重要的作用，是遗传毒性化学致癌物诱导细胞癌变的机制之一。组蛋白γ-H2AX在DNA损伤修复中起关键作用，我们的研究发现PP2A特异的调节亚基B56ε介导了DNA修复过程中γ-H2AX的去磷酸化，但具体的机制还有待阐明。B56ε还参与调控细胞凋亡，其本身的表达受到选择性翻译和凋亡蛋白酶的调控，提示我们B56ε可能在肿瘤发生过程中发生改变，进而影响DNA修复和细胞的癌变进程。我们拟通过多种化学致癌物诱导细胞恶性转化模型，在细胞转化的各个阶段检测B56ε的基因组DNA多态性、mRNA和蛋白表达形式与水平的变化，结合DNA损伤修复功能指标，以及B56ε功能增强或功能缺陷对细胞转化进程和结局的影响，探讨B56ε调控化学物致癌的分子机制，并初步评价B56ε作为肿瘤治疗辅助策略的可行性，拓展对PP2A肿瘤抑制功能的理解，进一步阐明DNA损伤修复缺陷与细胞转化的关系。

蛋白磷酸酶PP2A特异的调节亚基B56ε介导了DNA损伤修复的关键分子组蛋白γ-H2AX的去磷酸化，为了揭示B56ε在肿瘤发生过程中的改变及其影响DNA修复与细胞癌变的可能作用，我们利用化学致癌物苯并芘和硫化镍诱导恶性转化细胞模型，在诱导转化的不同阶段，检测B56ε的表达改变，并检测肺癌病例组织B56ε的表达作为验证。同时用中性单细胞凝胶电泳，组蛋白γ-H2AX的免疫印迹检测，流式细胞术分析细胞周期等方法检测了细胞转化各阶段的DNA修复功能。进一步通过对调节亚基B56ε的表达改变，研究B56ε对细胞恶性表型的影响。通过序列信息学分析和荧光素酶报告实验，寻找并验证可能靶向B56ε的miRNA。结果显示，转化各阶段细胞的B56ε表达在mRNA水平和蛋白水平均表现为持续上调，肺癌组织与对应的癌旁组织相比，B56ε的mRNA的表达与蛋白的表达水平均表现为普遍上调。中性单细胞凝胶电泳结果显示转化细胞均表现出较低的DNA双链断裂损伤程度和较快的修复时间。γ-H2AX的去磷酸化速度加快，发现转化细胞DNA由双链断裂引起S期阻滞不明显，这些结果说明在细胞转化过程中，DNA修复出现了异常。我们通过干扰B56ε的表达，发现细胞对遗传毒性化学物的毒性效应增强，细胞增殖受到抑制，在软琼脂上形成的集落减少。通过B56ε过表达，我们发现可以直接导致处于恶性变前期的L02R细胞直接发生恶性变。接着我们探索了B56ε表达上调可能的机制，序列信息学分析提示miR429可能是靶向调节B56ε基因的，通过构建荧光素酶报告载体，miR429可以调控B56ε基因的表达。我们进而检测了细胞中miR429的表达，结果显示miR429在转化细胞中普遍下调，与其对B56ε的负性调控功能相一致。综上所述，本研究揭示了B56ε在转化细胞和肺癌组织中的表达上调，与B56ε调控组蛋白γ-H2AX的去磷酸化，影响DNA修复进程有关，转化细胞的DNA修复功能发生异常，而且B56ε表达的改变可以影响细胞的恶性表型，可以作为肿瘤基因治疗的一个候选基因。此外，B56ε是miR429的靶向基因之一，转化细胞中B56ε的上调与miR429的低表达有关。本研究初步阐明了B56ε基因在遗传毒性化学物诱导细胞转化，影响恶性结局中的作用与调控机制，有助于全面理解PP2A在肿瘤抑制方面的功能，以及更深刻的理解DNA损伤修复与细胞转化之间的关系。