基于miRNA-214及其靶基因的调控探讨柠檬苦素治疗溃疡性结肠炎的作用机制

MicroRNAs play an important role on the occurrence and development of disease Ulcerative colitis (UC). Previous studies have demonstrated that limonin plays a critical role in the treatment of UC. But its exact mechanism has not been clarified. Limonin is highly distributed in different parts of the intestinal tissue, although only a small amount of drug was absorbed into the blood. The anti-inflammatory action of limonin is by inhibiting IL-17 and NF-κB cytokine, downstream effectors of miR-214 and STAT3 phosphorylation, up-regulation of PTEN and PDLIM2 in the treatment of UC. This project is to establish the UC animal model and explore the regulatory mechanism of limonin in the treatment of Ulcerative colitis based on IL-6/STAT3 signaling pathways by regulating miRNA-214 and the target gene PTEN and PDLIM2. Co-Immunoprecipitation, gene knockout and genome editing technique were employed to study the effect of limonin on miRNA-214 and target gene PTEN and PDLIM2 in order to discuss the mechanisms of limonin treating UC base on the cellular and animal levels and combined with clinical samples. The result will provide new ideas and evidences for looking for new drugs in TCM and the rational drug use in UC clinic treatments.

MicroRNAs在溃疡性结肠炎发生发展过程中发挥重要作用。课题组前期研究已证实柠檬苦素可显著改善溃疡性结肠炎（UC）动物模型的肠道炎症，但其作用机制不明确。本课题组进一步研究发现柠檬苦素能够显著下调miR-214和STAT3磷酸化表达水平，反向上调靶基因PTEN和PDLIM2表达水平进而抑制NF-kB等促炎因子的释放。本项目提出柠檬苦素可能通过介导IL-6/STAT3信号通路调控miRNA-214及其靶基因PTEN和PDLIM2抑制下游AKT、NF-κB信号通路以及炎症因子过度表达，修复肠道粘膜并改善肠道炎症。为此，本项目拟采用免疫共沉淀、基因编辑技术、基因敲除以及免疫组化等方法，在细胞和动物水平并结合临床样本进行研究柠檬苦素对miRNA-214及靶基因PTEN和PDLIM2的调控网络的作用，深入阐明柠檬苦素抑制UC的作用机制，为中医药治疗UC以及中药新药评价提供新的思路和依据。

UC的发生与微小RNA（microRNA, miRNA）以及IL-6、IL-17等细胞因子分泌失调等密切相关，因此，细胞因子转录水平的表达失控可能是UC发生的主要生物学机制。课题组通过研究发现柠檬苦素能够显著下调miR-214和STAT3磷酸化表达水平，反向上调靶基因PTEN和PDLIM2表达水平进而抑制NF-kB等促炎因子的释放。鉴于此，本项目提出柠檬苦素可能通过介导IL-6/STAT3信号通路调控miRNA-214及其靶基因PTEN和PDLIM2抑制下游AKT、NF-κB信号通路以及炎症因子过度表达，修复肠道粘膜并改善肠道炎症。.在我们的研究中，通过RT-PCR检测了溃疡性结肠炎患者以及正常志愿者结肠粘膜标本，发现在UC患者结肠中IL-6以及miR-214水平明显升高，而PTEN和PDLIM2表达下降。在动物实验中，我们证实了与模型组相比，柠檬苦素给药组的体重显著增加，结肠长度也相应增长，DAI评分降低。HE染色结果显示柠檬苦素组炎性细胞浸润减少，上皮损伤较少，组织完整。而炎症因子的检测结果说明给药组比模型组炎性细胞因子表达水平显著降低。以上实验结果都表明柠檬苦素可以改善DSS诱导的溃疡性结肠炎症状。在动物和细胞水平，我们分别取不同组别的结肠组织和细胞裂解物进行Q-PCR，WB，免疫组化以及ELISA的检测，结果显示柠檬苦素可以减少模型组中miR-214与p-STAT3的表达，相应地增加PTEN以及PDLIM2的表达，降低炎症因子IL-17，TNF-α的水平。为进一步验证实验，本研究在细胞水平设计了过表达和抑制miR-214实验，Q-PCR检测其表达，ELISA检测IL-17和TNF-α的表达。实验表明过表达miR-214使得细胞炎症因子水平升高，炎症加剧。但是在加入柠檬苦素后，可以观察到miR-214的表达在之前过表达的基础上降低。抑制miR-214使得细胞炎症因子降低，炎症降低，加入柠檬苦素后观察到miR-214的表达在之前抑制的基础上进一步降低，细胞炎症因子表达也进一步降低。可以说明柠檬苦素可以作为miR-214的拮抗剂发挥作用。.本项目从细胞和动物水平并结合临床样本进行研究柠檬苦素对miRNA-214及靶基因PTEN和PDLIM2的调控网络的作用，深入阐明柠檬苦素抑制UC的作用机制，为中医药治疗UC以及中药新药评价提供新的思路和依据。