PARP活性对人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞定向分化的作用

Human embryonic stem cells (hESCs) may serve as an unlimited source of retinal pigment epithelium (RPE) cells for transplantation in retinal degeneration diseases. However, the differentiation process of hESCs to RPE is not well defined and most often necessitates a long-term differentiation time with low efficiency; the ideal supplements for the induction of directed differentiation are still unclear. During our previous work, we found that addition of PJ34, an inhibitor of PARP activity, promotes the differentiation of hESCs to neuroectodermal progenitors and RPE, and increases Sox2 protein level.In addition, it is reported that Sox2 and Pax6 are required for neuroectodermal progenitors, PARP regulates transcription of Pax6, and PARP inhibition rescues hESC-derived neural progenitors from cell death.In view of the above,we hypothesized that PJ34 regulates Sox2 and Pax6 and inhibits cell apoptosis to promote differentiation of RPE from hESCs.In this proposal, we planed to use SHhES2, a hES cell line established by ourselves, to differentiate into RPE cells by PJ34. Then, we will study the role of PJ34 in differentiation through activation or attenuation of function of Sox2 and Pax6 and examination of apoptosis during RPE differentiation in the presense or absence of PJ34. Our study will not only supply a new way to direct differentiation of hESCs into RPE cells, but also facilitate the study of human retinal development and diseases.

人胚胎干细胞（hESCs）可为视网膜色素上皮细胞（RPE）移植治疗视网膜变性疾病提供无限细胞来源。然而，有效诱导hESCs向RPE分化的因子仍然不清楚。我们前期研究发现PARP活性抑制剂PJ34促进hESCs向神经前体细胞分化，进而促进RPE分化；抑制PARP活性显著增加Sox2蛋白水平。文献报道Sox2和Pax6都是神经前体细胞的决定因子，且PARP调控Pax6的转录，抑制PARP活性能保护神经前体细胞的存活。综上，我们提出假设：抑制PARP活性通过调节Sox2或Pax6并抑制凋亡，最终促进RPE分化。本研究拟在前期工作基础上，采用自主建立的hES细胞系SHhES2，利用PJ34诱导hESCs向RPE分化，通过基因过表达或RNA干扰等技术以及基因芯片和凋亡检测研究PJ34促进RPE分化的机制，为诱导hESCs向RPE分化提供指导和新的途径，并对揭示视网膜发育和视网膜变性的机制有重要意义。

人胚胎干细胞（hESCs）可为视网膜色素上皮细胞（RPE）移植治疗视网膜变性疾病提供无限细胞来源。已发现小分子化合物烟酰胺NIC、Chetomin能有效提高RPE的分化效率，但其发挥作用的具体机制尚不清楚。因此，探索hESCs向RPE分化的分子机制并优化RPE和视网膜神经元细胞的分化分法对hESCs治疗视网膜变性相关疾病仍然具有重要意义。.在本项目研究中，我们建立了一个联合应用四种分子来有效诱导hESCs向RPE分化的方法。在运用这种方法诱导hESCs向RPE分化过程中，我们首次发现聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶[poly (ADP-ribose) polymerase, PARP]的活性在分化早期被显著激活。通过PARP活性特异性的抑制剂PJ34或PARP1 siRNA抑制PARP活性显著降低神经视网膜相关基因PAX6、CHX10等的表达，并促进RPE的分化。进一步的研究发现，利用siRNA干扰PAX6或CHX10的表达，确实可以促进色素细胞生成和RPE相关标志基因的表达。更为重要的是，过表达PAX6或CHX10可消除抑制PARP活性对RPE分化的促进作用，说明抑制PARP活性促进RPE分化可能是通过降低PAX6或CHX10的表达而实现的。.此外，在项目研究过程中，我们建立了一种高效的、简单的分离体外诱导的RPE和视网膜神经元前体细胞(neural retina progenitor cells, RPC)的方法。研究发现将分化4-6周的具有色素的混合细胞群通过单细胞悬浮培养后，可形成具有定向分化命运的黑色和白色两类细胞球。分离黑色和白色球并分别贴壁培养，则可得到色素累积鹅卵石样的RPE细胞和表达有神经视网膜相关基因的视网膜神经细胞。这些结果提示悬浮培养的方法可将RPE和RPC从混合的分化细胞分离纯化出来。.综上，这些研究结果提示PARP参与RPE分化，抑制PARP活性可通过调节多种神经视网膜或RPE发育相关的关键基因来促进hESCs向RPE的分化，这对于精确指导hESCs向RPE分化有着重要意义。此外，通过单细胞悬浮培养的方法可从混合分化细胞中分离得到纯的RPE细胞，便于移植治疗。通过本课题的研究可以对hESCs定向诱导分化为RPE细胞提供指导和新的途径，建立高效诱导hESCs向RPE细胞分化的方法，为临床移植提供更为安全、有效、高纯度的细胞。