qPMCA技术定量研究血浆错误折叠蛋白质对阿尔茨海默病早期诊断的作用

The majority of reports have not detected statistically significant differences of plasma Amyloid-β protein (Aβ) levels in between patients with Alzheimer' s disease (AD) and healthy control subjects. Plasma Aβ levels show no apparent correlation with AD progression and degree of dementia. Thus the plasma Aβ's utility as a biomarker for AD is less compelling. Recent studies suggest the misfolded Aβ (Aβ seeds) could be potent biomarker for AD, however, no techniques have been reported for quantification of Aβ seeds. In order to elucidate the role of Aβ seeds as potent biomarker for early diagnosis of AD, we selected the APP23 transgenic mice for AD model in this project. We then estimated the plasma Aβ seeds level and seeding activity at different ages of mice by using the principle of quantitative protein misfolding cyclic amplification (qPMCA) technology we recently reported in the Nature Methods. We then observed the dynamics of plasma Aβ seeds level and seeding activity in mice. Compared the differences of plasma Aβ seeds level and seeding activity between APP23 transgenic mice and nontransgenic wild type mice. And then analyzed the correlation of plasma Aβ seeds level and seeding activity with cerebral β-amyloidosis. We experimentally explored the possibility of plasma Aβ seeds as AD biomarker. Then we provided evidence and a novel method for clinical study to utilize the plasma Aβ seeds as biomarker for early diagnosis of AD. This project will be significant and valuable for early diagnosis of AD.

血浆β-淀粉样蛋白（Aβ）浓度在阿尔茨海默病（AD）患者和健康人群之间无显著差异，与AD疾病进程及痴呆程度也无显著关联,因此过去基于血浆Aβ作为AD生物标记物的研究面临瓶颈。近期研究提示错误折叠的Aβ（Aβ晶种）可作为AD潜在生物标记物，然而未见相关技术能定量研究Aβ晶种。为了阐明Aβ晶种作为潜在生物标记物对AD早期诊断的作用，本项目拟以APP23转基因小鼠为AD模型，利用我们近期在Nature Methods报道的定量蛋白质错误折叠循环扩增（qPMCA）技术原理测定小鼠不同年龄段血浆Aβ晶种浓度和活力，观察二者的动态规律，比较二者在APP23转基因小鼠和野生型小鼠之间的差异，分析二者与小鼠大脑β淀粉样变性的关联，从实验水平探索血浆Aβ晶种作为AD生物标记物的可能性，为临床利用血浆Aβ晶种作为生物标记物进行AD早期诊断提供理论依据和新技术。本项目对AD早期诊断具有重要的理论意义与应用价值。

前期研究提示错误折叠的β-淀粉样蛋白（Aβ晶种）可作为阿尔茨海默病（AD）潜在生物标记物，然而未见相关技术能定量研究外周体液中的Aβ晶种，因此基于Aβ晶种作为AD生物标记物的研究面临瓶颈。命名朊蛋白（Prion）的诺贝奖获得者Prusiner教授近年通过体内实验提示Aβ晶种是一种Prion。在本项目中我们通过体外实验发现Aβ晶种具有与Prion晶种相似的生化特性，包括Aβ晶种具有蛋白酶抗性、Aβ晶种在变性后其蛋白酶抗性具有可逆性、Aβ晶种能将人工合成的Aβ转化为具有蛋白酶抗性的Aβ、Aβ晶种能激活小胶质细胞并调节相关蛋白的表达等。基于Aβ晶种是Prion或其特性与Prion晶种相似的假说，我们将前期自主研发的用于定量研究Prion晶种的定量蛋白质错误折叠循环扩增（qPMCA）技术进行了调整和优化，建立了用于定量研究Aβ晶种的qPMCA系统，包括体外扩增Aβ晶种、建立估算Aβ晶种含量的qPMCA标准曲线。然后利用已知浓度的人工重组Aβ晶种检验qPMCA系统检测Aβ晶种的灵敏性，结果显示该系统能检测到低至3.75fM的Aβ晶种。然后利用qPMCA系统检测AD模型动物（APP/PS1转基因小鼠）不同阶段（早期、中期和晚期）血浆Aβ晶种浓度。结果显示AD转基因小鼠早期血浆中Aβ晶种为11±7.2fM，中期为56.2±10.5fM，晚期为51.7±12.4fM。AD转基因小鼠中期和晚期血浆中Aβ晶种含量显著高于早期血浆中Aβ晶种含量（P<0.01），中期和晚期血浆中Aβ晶种含量之间无显著差异（P>0.05）。野生型小鼠早、中、晚期血浆中均未检测到Aβ晶种。此外，我们通过动物体内实验测定了AD转基因小鼠和野生型小鼠不同阶段（早期、中期和晚期）血浆对小鼠脑内AD病理特征淀粉样变性的作用，研究发现注射AD转基因小鼠血浆后均可促进小鼠大脑皮质及海马区Aβ斑块聚集，而注射野生型小鼠血浆则不能促进小鼠脑内Aβ斑块聚集。相关性分析显示AD模型动物不同阶段（早期、中期和晚期）血浆Aβ晶种的含量与AD模型动物不同阶段大脑淀粉样变性程度相关性强（r=0.886），提示血浆中的Aβ晶种含量能够反映大脑淀粉样变性程度。本研究从实验水平探索了血浆Aβ晶种作为AD生物标记物的可能性，为临床利用血浆Aβ晶种作为生物标记物进行AD早期诊断或辅助诊断提供理论依据和新技术，具有重要的理论意义与应用价值。