亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂脑神经细胞凋亡影响研究

Honey bees are important pollinators, but they are endangered by misuse of different kinds of insecticides. Neonicotinoid is a kind of widely used neurotoxin in pest control. The hazard from the insecticide is commonly expressed in terms of acute and stomach toxicity. However, there is no sufficient information regarding neurotoxin in the targeted location (nerve cells in brain). In chronic study, adult worker bees (Apis mellifera L.) will be fed with a series of sublethal doses of imidacloprid which is the representative of neonicotinoid. Apoptotic methods (including TUNEL, Annexin V, Caspase, transmission electron microscope, etc) will be used to detect the effects of imidacloprid on the apoptotic rate, expression of Caspase, and morphological characteristics of honey bee apoptotic nerve cells at tissue and cellular level. The objective of this study is to determine the effects of imidacloprid on honey bee nervous system using apoptotic detection methods. Meanwhile, the relationship between the extent of apoptosis in honey bee nerve cells and behavioral changes is expected to be carried on. The results here will provide a useful theoretical basis in estimating the harms of this neurotoxin insecticide at cellular level.

蜜蜂是自然界重要的授粉昆虫，却经常受到杀虫剂的危害。新烟碱类杀虫剂是目前广泛用于田间害虫防治的神经毒性杀虫剂。以往研究多关注此类杀虫剂对蜜蜂造成的急性毒性和胃毒影响，而作用靶标位置（脑神经细胞）的神经毒性研究少有报道。本实验拟以新烟碱类杀虫剂的代表品种吡虫啉作为供试材料，利用亚致死剂量吡虫啉饲喂成年意大利蜜蜂（Aips mellifera L.）并引起其慢性中毒，通过细胞凋亡技术（包括TUNEL 、Annexin V 、Caspase 和透射电镜等方法），在脑组织和脑神经细胞水平对吡虫啉造成的蜜蜂脑神经细胞凋亡百分率、Caspase的表达和凋亡细胞的形态学特征等方面进行系统研究，即利用细胞凋亡技术研究吡虫啉对蜜蜂的神经毒性影响；同时，探索蜜蜂脑神经细胞凋亡与其行为变化之间的关系，为建立细胞水平的神经毒剂类杀虫剂评价体系提供理论依据。

蜜蜂是重要的授粉昆虫，却受到新烟碱类杀虫剂的持久危害。该类杀虫剂主要作用于昆虫中枢神经系统，而有关此类杀虫剂对靶向位置—蜜蜂脑神经细胞影响的研究较少。吡虫啉为此类杀虫剂的代表品种，本研究利用亚致死剂量吡虫啉饲喂成年意大利蜜蜂，通过原位末端标记法（TUNEL）检测脑神经细胞的凋亡情况，利用免疫荧光法和qRT-PCR技术检测Caspase基因的转录和激活情况，通过透射电镜观察脑神经细胞的超微结构；还进行了蜜蜂行为学检测，并结合转录组实验结果对吡虫啉引起的蜜蜂中毒机制进行了研究。结果表明：在经口摄入亚致死剂量的吡虫啉诱导成年意蜂工蜂脑神经细胞凋亡率随时间递增而增加；处理组Caspase-3阳性细胞率与空白对照组差异显著且处理组caspase-1基因表达量较空白对照组显著增加。凋亡率和Caspase-3阳性细胞率均具有时间和剂量效应，且两者成正相关性。超微结构表明凋亡的神经细胞呈现凋亡和自噬双重特征，包括细胞核固缩、染色质浓缩、凋亡小体和自噬体出现；线粒体肿胀，有的被自噬泡包裹后进行线粒体自噬。此外，吡虫啉能够引起蜜蜂爬行和学习记忆能力减弱。本研究从细胞水平证实了亚致死剂量吡虫啉对成年意大利蜜蜂工蜂脑神经细胞具有致凋亡作用，并且与Caspase依赖型凋亡和自噬有关，这为利用细胞凋亡法评价杀虫剂对非靶标生物的神经毒性提供一定的理论基础。另外，推测蜜蜂爬行能力的减弱受到蜜蜂脑神经细胞凋亡与自噬、肌肉相关功能基因表达的下调及中枢神经系统神经信号的转导受阻等多重影响所致，该结果也使人们对新烟碱类杀虫剂引起蜜蜂中毒机理有了更深的认识，为更好的保护该物种提供一定的理论依据。. 此外，新烟碱类杀虫剂与蜜蜂病毒的协同作用是目前公认的导致蜂群崩溃失调现象的主要诱因之一，也是本研究的延续性内容。为此，本研究为掌握我国蜜蜂病毒的流行特性开展了全国普查工作。结果表明我国意大利蜂群蜜蜂病毒混合感染率接近100%，尤其是蜜蜂慢性麻痹病引起的危害最为严重；因而，我国防范蜜蜂病害协同爆发的形势严峻且亟待解决。