基于单分子力谱方法研究病毒融合肽与脂膜相互作用的物理机制

针对一类病毒（如人流感病毒）侵染细胞的关键步骤：融合肽与细胞膜的结合与作用，本项目将应用单分子力谱方法（微吸管皮牛测力系统和平行大通量高灵敏磁场力系统），通过调节外力和溶液环境等条件，对此类病毒融合肽在脂膜中的寿命进行单分子测量。而融合肽在外力下的寿命是直接揭示形成融合孔的必要条件，这也是迄今尚未完全解答的基本问题。通过时间分辨的动态过程研究融合肽与脂膜相互作用的能量图谱，并结合分子动力学模拟阐述融合肽导致病毒与胞膜融合（病毒感染的关键步骤）的物理机制。本项目将系统合成一系列相关病毒融合肽（流感、SARS和HIV等病毒及序列突变），在单分子层面揭示其与脂膜作用的热力学性质及动力学过程。新发展的平行大通量磁力系统具有皮牛的灵敏度，能够同时对大量非同步随机过程进行定量测量，是适用于不可逆单分子实验的新方法。既是完成本项目的重要工具，也是对单分子力谱方法的重要延伸，可用于多种分子的相互作用研究。

本课题针对病毒融合肽与宿主细胞膜相互作用这一病毒侵染细胞的关键动力学过程展开了相关的单分子力学研究。我们首先适用于单分子研究的融合肽与磷脂膜相互作用的样品体系，我们（中空、玻璃）微球或玻片表面包裹上一层磷脂双分子层用来模拟细胞膜表面，将病毒融合肽插入磷脂膜中，一端连接于另一微球上，使用单分子力谱系统来测量融合肽在磷脂膜中的停留时间。同时，我们基于电子光学的原理研制了一种新型的电磁装置，该装置可以同时对大量磁性微球进行平行大通量单分子力学测量；通过使用一种简单的瞬时高压产生系统，该装置可以在5ms时间内，在直径1mm的范围内产生一个均匀的最大约20pN的作用力；我们进一步对该装置进行生物学应用验证，其可以同时拉伸多于50根单分子双链DNA，双链DNA长度与外力的对应关系与已有经典理论一致，从而验证了该装置的实验有效性。我们将新发展的平行大通量单分子力学测量系统应用于病毒融合肽与细胞膜相互作用研究中，测量了在不同恒定外力下流感病毒融合肽在磷脂双分子层中的停留时间。同时，我们使用微吸管系统测量了不同拉速下流感病毒融合肽与磷脂膜分离的作用力；并进一步改变环境pH，用微吸管系统分别测定pH 7.4与pH5.0下，不同拉速下融合肽与磷脂膜相互作用，通过数据分析得到了不同pH环境下融合肽离开细胞膜的能量景观。将上述实验结果与分子动力学模拟分析相结合，我们推测了融合肽在不同pH 值下的构象与其动力学稳定性的对应关系，在一定程度上阐明了病毒侵染细胞的物理学过程。