TRPM2调节尿酸钠晶体诱导NETosis的作用和机制

Sterile inflammation induced by damage-associated molecular patterns (DAMPs) released from necrotic cells is major pathogenesis of a variety of chronic autoimmune diseases. Support by project from National Natural Science Foundation of China, we previously found that stimulating neutrophils with monosodium urate (MSU) crystals resulted in reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ dependent NETosis and formed neutrophil extracellular traps (NETs) or aggregate NETs to mediate pro-inflammation or inflammation resolution, respectively. The aim of this project is to explore regulating target of MSU crystals-induced acute inflammation.Taken into account that TRPM2 establishes a bridge between ROS and Ca2+, we hypothesized that TRPM2 regulated NETosis induced by MSU crystals to affect acute inflammation. In this study, we will investigate effect of TRPM2 on NETosis induced by MSU crystals in vitro and in vivo, as well as acute inflammation. Meanwhile, modulation mechanism and roles of ROS and Ca2+ in TRPM2 regulating NETosis will be identified. The research will make contributions to scientific field of DAMPs-induced inflammatory disorders. Furthermore, it may enlighten discovery of regulatory target to maintain the balance of immune system.

细胞坏死释放损伤相关分子模式(DAMPs)诱导无菌性炎症是多种自身免疫病的发病基础。在国家自然科学基金资助下，我们发现尿酸钠(MSU)晶体刺激中性粒细胞，使其以活性氧(ROS)和Ca2+依赖的NETosis形式死亡，形成中性粒细胞胞外陷阱（NETs）或聚集性NETs，分别介导急性炎症发生或炎症消退。本课题旨在探索调节MSU晶体诱导急性炎症反应的靶点。课题从“ROS—TRPM2—Ca2+”这一桥梁出发，以TRPM2调节MSU晶体诱导NETosis，从而影响急性炎症反应为中心假说，通过观察体内外调节TRPM2水平对MSU晶体诱导NETosis的影响及其介导急性炎症反应的作用，以及探讨ROS和Ca2+在TRPM2调控MSU晶体诱导NETosis中的特异性作用机制，从而阐明并验证课题假说。研究不仅对DAMPs诱导炎症反应的机制研究具有科学贡献，而且可能对发现免疫平衡的调节靶点有一定的启示作用。

急性炎症中单钠尿酸盐（MSU）晶体可刺激PMN形成NETs或聚集性NETs（aggNETs），分别介导急性炎症发生或炎症消退。TRPM2是否参与NETosis过程尚不明确。本研究发现MSU晶体在不同PMN密度下诱导NETs形成的能力不同。细胞密度低时，MSU晶体可诱导形成分散的、非聚集的NETs；细胞密度高时，MSU晶体诱导聚集性NETs形成，且细胞密度越大，aggNETs越明显； WT NETs多为刺突状及类刺突状，而基因鼠多为云雾状及刺突状； 基因鼠游离DNA水平偏低，NETs产生减弱；MSU刺激，基因鼠胞内Ca2+水平，胞内ROS产生显著低于WT小鼠；背部气囊及腹腔内注射MSU晶体后，在WT小鼠体内MSU晶体多聚集在气囊局部，而基因鼠MSU晶体多均匀分布，提示基因鼠产生aggNETs能力下降；WT小鼠气囊壁内偶见NETs形成，基因鼠几乎未见到NETs形成；基因鼠气囊灌洗液上清内游离DNA水平显著降低,气囊内ROS下降，炎性细胞浸润减少，MPO表达降低，PMN、巨噬细胞比例显著降低，炎性单核细胞虽有降低的趋势；IL-1β、IL-6、TNF-α产生减少；足跖炎症模型中，基因鼠足跖肿胀较WT小鼠减轻，且缓解较快；足跖内炎性细胞浸润及滑膜增生减轻，骨质破坏减少。在慢性炎症中，抗原诱导关节炎小鼠模型中TRPM2的作用尚不明确，本研究发现mBSA诱导小鼠关节炎后,TRPM2-/--AIA 小鼠的膝关节肿胀较对照组明显加重，炎性细胞浸润、滑膜增生明显高于对照组;TRPM2-/--AIA小鼠的膝关节中性粒细胞、巨噬细胞浸润比对照组明显增加，炎性单核细胞比例无明显变化;TRPM2-/--AIA小鼠腹股沟腹股沟淋巴结Th17细胞比例较WT-AIA小鼠增加;TRPM2-/--AIA膝关节炎性细胞因子 IL-6、IL-8趋化因子 CXCL6 较 WT-AIA 小鼠明显增加。结论：在急性炎症模型中,TRPM2调节胞内Ca2+水平及ROS产生，参与调控MSU晶体诱导NETosis形成；TRPM2缺失后，可减少PMN、巨噬细胞的浸润，降低IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌，减轻MSU晶体诱导急性无菌性炎症反应。在慢性炎症模型中，TRPM2 缺失后增加膝关节中性粒细胞和巨噬细胞的浸润，增加 IL-6、IL-8、CXCL6 等细胞因子的产生，加重关节局部炎症。