基于以微生物次生代谢物和生物转化产物为药效物质基础的发酵类中药六神曲的炮制原理研究

六神曲是传统常用中药材，作为发酵类中药，缺乏现代研究，致使药效物质基础和药效作用机制不明确、质量标准和生产工艺落后。与一般认为益生菌及其发酵产生的活性酶是其药效物质的认识不同，本课题在充分进行文献和临床应用研究的基础上，从古人应用六神曲的真正意图入手，首次提出了六神曲发酵过程中微生物所产生的小分子次生代谢产物和原料中药生物转化产物可能为其药效物质基础，其抗胃肠道病原微生物的药理作用更能体现六神曲传统功效的研究思路，拟采用中药炮制学、中药化学、微生物学、药理学、现代生物技术等多学科集成攻关，对六神曲的药效物质基础、药效作用机制和炮制原理进行系统深入研究，研究内容包括有效部位与有效成分的确定、以抗胃肠道病原微生物作用为指标的药效作用机制，有效发酵菌株的确定、发酵工艺和质量标准研究及炮制原理研究。本课题还可能发现新的抗感染化合物，并为其它发酵类中药提供了新的研究模式和借鉴，具有重要的科学价值。

本项目建立了六神曲药效物质总有效部位，乙酸乙酯组分，正丁醇组分以及单体化合物的制备方法。并研究了它们对肠道致病菌、常见致病菌的抗菌活性，探讨其治疗外感食积不化、腹泻的作用机理。在六神曲不同炮制品乙酸乙酯提取部位指纹图谱对比研究中，发现微生物将其中的部分成分分解并且转化成其他化学物质发挥药效作用，分析并确定未发酵六神曲和发酵生六神曲乙酸乙酯提取部位差异性最大标记物。在体内抗菌作用研究中，炒神曲乙酸乙酯提取部位具有很强的抗菌效果。在MDCK细胞为模型中，发现乙酸乙酯有效部位对流感病毒增殖有较明显的抑制作用。在家兔耳源静脉注射大肠杆菌和酵母菌的混合悬液所致的实验动物发热模型研究中，发现乙酸乙酯有效部位具有很好的解热作用。在小鼠自家粪便腹腔注射所致急性细菌性腹膜炎为模型中，发现乙酸乙酯有效部位能够通过减少炎症介质和细胞因子的生成，减轻对腹膜炎小鼠的损伤。从传统发酵六神曲分离得到3株真菌，通过显微形态学和DNA测序鉴定，确定3株真菌分别为曲霉属真菌黄曲霉菌，青霉属真菌产黄青霉菌以及枝孢属真菌枝孢霉菌。以单一菌株发酵替代六神曲原有自然发酵，其中黄曲霉菌和产黄青霉菌发酵六神曲与传统发酵相似。考察黄曲霉菌及产黄青霉菌发酵六神曲95%乙醇提取物对8种肠道致病菌的抑制作用，发现黄曲霉菌及产黄青霉菌六神曲提取物对肠道致病菌具有显著抑制作用。通过ELISA检测黄曲霉毒素B1含量，产黄青霉菌发酵六神曲中黄曲霉毒素B1含量符合限定标准。在产黄青霉菌单一菌株发酵六神曲与市售六神曲确认的化学成分比对中，市售六神曲主要化学成分在产黄青霉菌发酵六神曲中共表征16个相同化合物，确定六神曲最优发酵工艺。进行10个批次的发酵试验，建立以川芎哚含量测定及有效部位的抑菌活性效价为指标的药物效能限定标准，制订出质量标准。