单分子技术研究sgRNA-Cas9复合体对靶DNA的识别与切割的分子机制

Many of the noncoding RNAs play important roles in gene regulation through ribonucleoproteins (RNPs), studies on the structural dynamics of these RNPs may help us to unravel the molecular mechanism in these regulation processes. CRISPR/Cas system confers adaptive immunity against exogenic elements in many bacteria and archaea. It uses small noncoding RNAs which are transcribed from invasive genetic elements as guide to target and cleave the invasive DNA. The CRISPR/Cas9 system has been used as the most effective genome-editing tool. However, the severe off-target effects limit its application. In this application, we plan to use sgRNA-Cas9 complex as a model system to study the process of DNA targeting and digestion by sgRNA-Cas9 complex by combining use of single-molecule fluorescence, single-molecule force spectroscopy and computational biology methods. We plan to study the structural dynamics of sgRNA-Cas9 complex and their regulation, and finally try to provide structural basis for the design of new CRISPR/Cas9 system with low off-target effects.

许多非编码RNA通过形成核糖核蛋白复合体（RNPs）的形式发挥其基因调控功能，因此研究这些RNP动态特性及其作用机制，对于深入认识非编码RNA的功能及调节机制有着非常重要的意义。CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌抵御外来基因入侵的后天适应性免疫系统，它通过来源于外源基因片段转录产生的非编码RNA的引导实施对外源基因的破坏。由此发展而来的CRISPR/Cas9系统已成为最有效的基因编辑工具。然而，严重的脱靶效应大大限制了其应用。本项目拟以CRISPR/Cas9系统中发挥关键作用的sgRNA-Cas9蛋白复合体为研究对象，综合利用单分子力学操纵技术、单分子荧光、以及分子动力学模拟等手段研究该核糖核蛋白复合体的动态特性及其识别调控机制。研究sgRNA-Cas9复合体识别并切割靶DNA的动力学过程，阐明其分子机制，为新型低脱靶率CRISPR/Cas9系统的设计提供指导。

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌抵御外来基因入侵的后天适应性免疫系统。近年来，基于II型CRISPR系统发展起来的基因编辑工具，因其设计简单、特异性强、效率高等优点，已成为最有效的基因编辑工具，被广泛用于基础理论、基因诊断以及临床治疗等领域。然而该系统仍存在核酸酶分子量过大，体内编辑效率较低，以及明显脱靶效应等缺陷。本项目中，我们综合运用常规生物化学手段、单分子生物学以及分子动力学模拟等技术对CRISPR-Cas9系统和CRISPR-Cas12a系统的R-loop复合体形成的详细分子作用机制进行了系统研究。我们发现，Cas9-sgRNA复合体将靶DNA序列分成多个功能区域：PAM、linker、seed、middle以及tail区。这些区域在R-loop的稳定性上发挥着不同的功能，对碱基错配的敏感度也有比较大的差异。Cas9-sgRNA复合体与靶DNA在形成R-loop过程中，至少经历一个高度动态的中间构象状态。这一中间态的稳定性，对于Cas9蛋白的切割活性密切相关。以此为基础，我们对SpyCas9蛋白的HNH结构域进行多种突变及改造，筛选具有高活性及高特异性的Cas9突变体，同时对Cas9蛋白进行工程化改造，开发了两种具有可切换活性的Cas9蛋白嵌合体。随后，我们对CRISPR-Cas12a系统R-loop复合体的形成及结构稳定性进行了研究。研究发现，当crRNA和靶DNA的碱基配对长度达到18bp时，R-loop结构达到一种稳定的检查点状态，此时Cas12a采取一种活性构象为随后靶DNA的切割做准备。一旦稳定的R-loop结构形成，Cas12a会率先对非目标链进行切割，由于非目标连与Cas12a的结合相对松散，因此它会很容易地从Cas12a酶切中心释放出来，随后闲置的RuvC活性中心又会和目标链结合并进行切割。在这一过程中，Cas12a的Nuc结构域通过与非目标DNA的结合，抑制靶DNA双链的再退火从而稳定形成的R-loop结构。