Wnt5a下游信号通路及miRNA在肛门直肠畸形发生中的作用的研究

Congenital anorectal malformation (ARM) is the most common gastrointestinal malformations which influenced the quality of life of the patients severely. However, as ARM is a multigenerational complex disease, the pathogenesis of ARM is unknown. Recent studies have shown that downstream signaling pathways of Wnt5a play important role in the pathogenesis of ARM, but the mechanism is unknown. Downstream genes involved in Wnt5a signaling pathway are very complex. The exact signaling pathways involved in the pathogenesis of ARM remain unknown. In this study, we will use biopsies from ARM patients and ethylenethiourea (ETU) induced ARM rat fetus, focusing on the Wnt5a downstream genes which were considered to be involved in ARM development, to study the role of these genes in ARM generation. Both the expression levels and mutations will be detected. On the other hand, considering the importance of miRNAs in embryonic development, the specific miRNA profile in ARM will be studied by miRNA array. At the end, the genes and miRNAs identified and validated in animal models will be used to develop the ARMs-specific chip for prenatal screening.Our research lays a foundation for genetic intervention, prenatal diagnosis and prevention of human congenital ARM.

肛门直肠畸形（ARM）是最常见的消化道畸形，严重影响儿童的生活质量。由于ARM是复杂的多基因疾病，迄今其发病机制仍不清楚。目前研究发现Wnt5a下游信号通路在ARM发生中发挥重要作用，参与Wnt5a信号通路的下游基因非常复杂，哪些信号通路涉及ARM的发生及其作用机制仍不清楚。本项目在前期研究基础上，拟采用ARM患者的外周血和直肠组织标本以及乙烯硫脲诱导的大鼠产生的ARM胎鼠模型，检测和分析Wnt5a下游基因的表达和突变，筛选出Wnt5a下游参与ARM发生的基因，同时通过miRNA芯片研究ARM特异的miRNA表达谱，应用转基因动物模型验证miRNA和筛选出的Wnt5a下游基因与ARM的发病关系，探讨Wnt5a下游信号通路及miRNA在ARM发生中的作用机制，同时将验证结果用于研发产前筛查ARM的特异芯片，为人类ARM产前诊断、遗传干预和畸形防治奠定基础。

1、芯片筛选正常和ARMs胎鼠后肠组织中差异表达的miRNA。取正常组和ARMs组14-16天胎龄（GD14-16）大鼠后肠组织，进行大鼠miRNA芯片检测并进行生物信息学分析。.结果显示：相对于正常组，ARMs组中，GD14有38个miRNA上调；GD15有 32个miRNA上调，17个下调；GD16有42个miRNA上调。RT-qPCR验证，发现miR-125-2-3p、miR-92a-2-5p、miR-99a-5p在组间差异显著，其中miR-92a-2-5p在miRNA-靶基因-信号通路网络中与靶基因、信号通路联系最为广泛。.2、miR-92a-2-5p与PRKCA靶向关系的确认，以及二者在正常和ARMs胎鼠后肠组织中的时空表达情况。荧光原位杂交、IHC、TUNEL分别探索miR-92a-2-5p、PRKCA、TUNEL的时空表达模式，同时WB检测PRKCA蛋白表达量；TargetScan预测PRKCA上miR-92a-2-5p的结合位点，双萤光素酶实验验证靶关系。.结果显示：miR-92a-2-5p与PRKCA存在直接靶关系。miR-92a-2-5p在ARMs中高表达，且分布区域与TUNEL信号相似；PRKCA在ARMs中低表达。.3、miR-92a-2-5p对靶基因PRKCA及下游效应分子β-catenin表达量的影响以及对大鼠肠上皮细胞功能的作用。大鼠肠上皮细胞中过表达miR-92a-2-5p或si-PRKCA后，Western Blotting检测PRKCA、β-catenin蛋白表达水平，实验检测细胞周期、细胞增殖、caspase 3/7相关凋亡，并使用流式细胞术了解早/晚期凋亡细胞比例的变化。.结果显示：过表达miR-92a-2-5p或敲降PRKCA后，PRKCA蛋白表达水平下降，而β-catenin表达水平上升。细胞免疫荧光结果显示，过表达miR-92a-2-5p或沉默PRKCA可引起β-catenin亚细胞定位改变，使其在细胞核内聚集。过表达miR-92a-2-5p后细胞死亡增多，且具有剂量依赖性，miR-92a-2-5p浓度越高，细胞死亡越显著。过表达miR-92a-2-5p后可引起大鼠肠上皮细胞G1/S期阻滞、增殖减弱、凋亡增多，凋亡以晚期凋亡为主，早期凋亡比例也少量增加；沉默PRKCA后也出现相似的结果。