组蛋白去甲基化酶KDM4C调控神经母细胞瘤增殖与代谢的分子机制研究

Neuroblastoma is a common solid tumour in children. Clinically, neuroblastoma is a heterogeneous group of tumors, with the characteristics of high malignancy and high risk of metastasis and recurrence. Therefore, the investigation of the mechanism of neuroblastoma development and the exploration of new targets for therapy is a effective approach to improve neuroblastoma patients survival rate. The result of our recent study showed that histone demethylase KDM4C plays an important role in neuroblastoma cell proliferation and metabolism. However, the molecular mechanism of KDM4C-regulation is still unclear. In this study, we will firstly investigate the effects of KDM4C on proliferation and metabolism of neuroblastoma cell. Secondly, we will be devoted to investigate how KDM4C regulates metabolic enzymes and how deregulated metabolites alter cell signaling by ChIP-seq and ChIP-qPCR. Thirdly, we will find the interaction of KDM4C and some activating transcription factors by immunoblotting, GST pull-down and Co-IP experiments. Finally, we will investigate the mechanism of KDM4C epigenetic regulation in the process of cell proliferation and metabolism by time-course qRT-PCR analysis, rescue experiments and patient derived tumor xenografts (PDTX) and so on. Collectively, the aim of the study is to clarify the link between H3K9 methylation and neuroblastoma cell proliferation and metabolism, and explain the molecular mechanism of KDM4C epigenetic regulation, then provide KDM4C as a potential therapeutic target for neuroblastoma treatment.

神经母细胞瘤(Neroblastoma, NB)是儿童常见肿瘤，具有恶性程度高和预后差等特点；研究NB的发病机理和探索新的治疗方法改善患者预后，是提高病人生存率的有效途径。申请人近期研究发现组蛋白去甲基化酶KDM4C对NB增殖和代谢具有重要作用。本项目拟研究KDM4C对NB细胞增殖和代谢的影响；并通过基因芯片分析筛选出KDM4C表观调控NB细胞增殖和代谢的信号通路，采用ChIP-seq鉴定KDM4C表观调控的靶标基因；再通过Co-IP、GST pull-dowan等实验分析KDM4C与某些调控转录激活因子等靶标蛋白的调控方式；最后利用营养物质补救实验和异种体内肿瘤移植实验等进一步明确KDM4C表观调控NB增殖和代谢的分子机制。总之，本项目拟阐释H3K9的甲基化对NB细胞增殖和代谢之间的表观调控关系，从分子水平上明确KDM4C表观调控NB细胞增殖和代谢的作用机制，为临床治疗NB和改善患者预后状况提供新的策略。

组蛋白去甲基化酶KDM4C在多种肿瘤细胞中都是高表达的，包括淋巴瘤，乳腺癌，食管鳞状细胞癌，肺肉瘤样癌和人髓母细胞瘤。因此，本项目针对KDM4C的研究可能为肿瘤治疗相提供一些基因靶标的参考。本项目对KDM4C调控肿瘤细胞生长增殖和氨基酸代谢的表观遗传学机制进行了探究；同时发现了KDM4C与转录激活因子ATF4之间的关系；这都说明KDM4C在肿瘤发生发展中有着非常重要的作用。首先，KDM4C对于肿瘤细胞生长增殖和氨基酸代谢是必须的。我们的MTT、BrdU、Western和ChIP-seq等实验的结果显示KDM4C对肿瘤细胞生长增殖和氨基酸代谢起着重要的作用，且缺少KDM4C后丝氨酸-甘氨酸合成通路将无法被转录激活。其次，过表达KDM4C可转录激活丝氨酸合成通路进而促进肿瘤细胞的增殖。将KDM4C过表达后，发现肿瘤细胞内H3K9me3显著下降，而H3K9me1则显著上调，且H3K9me2无变化。同时过表达KDM4C不仅提高了肿瘤细胞的增殖能力，还提高了其在动物体内形成肿瘤的能力。另外，ChIP-qPCR实验结果显示，过表达KDM4C可提高其与PHGDH和PAST1启动子DNA区域的结合度。这KDM4C是通过H3K9的甲基化水平表观调控肿瘤细胞生长增殖和氨基酸代谢的。再次，KDM4C需ATF4介导转录激活肿瘤细胞的氨基酸代谢。我们的实验结果显示KDM4C可直接上调或下调ATF4的mRNA 或蛋白表达，且KDM4C可结合在ATF4的启动子区域；这说明ATF4是KDM4C的下游靶基因。另外，我们先将KDM4C过表达然后再沉默ATF4，结果显示沉默ATF4几乎完全抑制了KDM4C促进肿瘤细胞增殖的能力，也几乎完全抑制了KDM4C对丝氨酸合成通路各基因的上调作用；同时KDM4C和ATF4与丝氨酸合成通路基因PHGDH启动子区域的结合也下降了，而H3K9me3与PHGDH启动子区域的结合却又显著性的升高。这说明ATF4与KDM4C可能是结合在一起共同地发挥生物学功能；而Co-IP实验证实ATF4和KDM4C确实是结合在一起的；这说明KDM4C和ATF4结合在一起对丝氨酸生物合成信号通路基因进行转录调控作用的。总之，本项目成果显示以KDM4C为基因靶点设计抗肿瘤药物具有可行性和潜在的应用前景，同时为神经母细胞瘤的临床治疗提供了新的思路，具有重要的临床意义和应用转化潜能。