异型花柱植物莕菜两型花间差异基因的克隆及表达分析

Heterostyly (including distyly and tristyly) is a genetic controlled floral polymorphism. Heterostyly is one of the classic sexual systems and has been a model system in the study of plant evolution and adaptation. Since Darwin, the origin, evolution and genetic mechanisms of heterostyly has been a hot spot of evolutionary biology, but little is known of the molecular genetic basis of the heterostyly. The aquatic plant Nymphoides peltata (Menyanthaceae) is a typical distylous plant and is an ideal material for studying the molecular genetic basis of the distyly. In the our previous research, the transcriptome sequencing experiments have been conducted on the materials from the long- and short-morph flower of N. peltata. Based on the transcriptome sequences, firstly in this project we are to validate gene fragments reliability by using PCR amplification and Real-time quantitative PCR techniques, and then to study the temporal and spatial expression patterns of these identified genes in different floral organs. After indentifying the genes showing differential expression between morphs in developing flowers of N. peltata, we then to clone and sequence these genes and to study the gene structure and protein function. The aims are to link the differential expressed genes to the floral morphogenesis, which could provide a basis for the subsequent in-depth study on the molecular genetic basis of distyly.

异型花柱是受遗传控制的花的多态现象，包括二型花柱和三型花柱。异型花柱是自然界中较为典型的植物性系统之一，也是进化生物学工作者研究植物进化和适应问题的经典范例。自达尔文以来，异型花柱的起源、演化及其遗传控制机制等方面一直是进化生物学研究领域的热点，但目前对异型花柱分子遗传基础却知之甚少。水生植物莕菜为典型的花柱二型性植物并具有诸多研究二型花柱分子遗传机制的有利条件，是研究该问题的理想材料。本项目拟在前期对莕菜不同花型转录组测序的基础之上，选择其长、短花型间差异显著的基因，并进行PCR扩增测序及荧光定量PCR验证其可靠性；同时对这些差异基因进行不同花型间不同组织器官中时空表达模式研究，确定长、短花柱型植株中特异表达的基因，并对这些基因进行分子克隆和结构分析；建立特异表达基因与莕菜不同花型形态建成间的联系，为后续全面深入揭示花柱二型性的分子遗传基础提供基础。

异型花柱的起源、演化及其遗传控制机制等方面一直是进化生物学研究领域的热点，但目前对异型花柱分子遗传基础却知之甚少。本项目采用转录组测序的方法，开展了水生植物荇菜其异型花柱分子遗传学机制的研究。经过三年的野外调查及室内实验分析，本课题组已基本按照计划完成所定的内容，同时根据研究结果情况适时对实验中出现的新的情况进行了安排。在此期间，项目组在花柱二型性水生植物莕菜两型花的发育过程观察、两型花间转录组测序组装、同源基因发掘、差异表达基因鉴定和验证以及相关基因的功能分类方面取得了一定的研究结果：（1）在莕菜的花期，我们对具有长、短柱的花芽的发育过程进行了详细的体式显微镜观察。依据观察结果，我们将莕菜花芽的发育分成了四个时期。这些时期的决定为后期差异基因的差异表达的研究提供了形态上的对照。（2）我们对莕菜两种花型（用于RNA提取的每种花型的材料均为不同时期花芽的混合）分别进行了转录组测序，并开展了转录组的组装分析。所测得的莕菜两种花型转录组为后续的同源基因的筛选、差异表达基因的鉴定提供了可参考的转录组数据。（3）基于所测的转录组数据，对不同花型莕菜个体间同源基因进行了鉴定和功能分析，为发掘参与异型花柱发育的基因提供了数据库。另外，我们开展了依据莕菜转录组测序开发SSR分子标记的工作。获得了大量新的SSR分子标记，这些标记能为莕菜异型花柱遗传连锁图谱的构建提供大量的分子标记。（4）对莕菜花发育过程中3个时期（2 mm, 3 mm 和5 mm）的长短花型的花芽进行了表达谱的高通量测序，并进一步对同一花型及不同花型间差异基因表达模式进行了聚类分析。同时对得到每个差异基因进行了GO注释和显著富集的Pathway分析。明确了哪些更相关的基因参与到莕菜不同花型，不同发育时期的调控当中。本项目的研究结果为后续全面深入揭示花柱二型性的分子遗传基础提供了基础数据。