基于应拉木形成的基因筛选与功能解析

Tension wood is abnormal timber with pith on one side, and presence of an inner, distinguished gelatinous cell-wall layer.In recent years, they have attracted as the model material for plant cell wall synthesis due to their walls have a desirable chemical composition (low lignin, low hemicellulose, and high cellulose contents) for applications such as saccharification and biofuel production. In here, the expression profiling data of tension wood and normal wood has been studied, and 684 different expressed genes in tension wood have been primarily found. then 120 candidate genes were further selected by comparing the expression data in different tissues of poplar tree and analysizing corresponding Arabidopsis homologous gene. With reverse genetics methods, T-DNA insertion mutants of 120 genes have been ordered from Salk Arabidopsis Center. we will identify cell wall composition using those mutant stems, and hope to get 5-10 candidate gene mutants with obvious phenotype or chemical composition difference. then we will further characterize the function of those genes in plant. On the base of Arabidopsis results,2-4 candidate genes in the poplar will be selected to do RNA interference. then we will measure the target genes expression level, compare the growth situation, and detect the cell wall components in the transgenic poplar trees. This project can not only enrich our understanding of the regulation mechanisms of plant secondary growth, and will also find new resources and materials for development and utilization of forest biomass energy.

应拉木是一种非正常的、髓心偏向一侧的木材，内层是特殊的胶质层。近年来，由于其特殊的化学成分- - 纤维素含量升高、而半纤维素、木质素含量下降，成为研究植物细胞壁合成的模式材料。本研究通过对应拉木与正常直立木表达水平差异的比较研究，筛选获得了684个差异较大的基因，在此基础上，进一步通过表达水平的验证和拟南芥同源基因的分析，共筛选了120个候选基因。利用反向遗传学原理，通过从拟南芥中心获得相对应基因的T-DNA插入突变体，进行突变体鉴定，细胞壁组分分析、希望从拟南芥中筛选到5-10个候选基因，并对其进行进一步的功能分析等。在此基础上，在杨树中挑选2-4个候选基因，通过RNAi来下调杨树中的目标基因，鉴定这些转基因杨树的生长、材性及细胞壁组分的变化。本项目的研究不仅可以丰富我们对植物次生生长调控机理的了解，还将为林木生物质能源的开发与利用寻找到新的资源与材料。

对源于组织培养的1年生杨树应拉木和正常木，将茎的横切片分几个不同区，其中应拉木分6个区，正常木分3个区。分区的标准是根据细胞壁的沉积厚度，从0-250um区，正常木和应拉木的细胞壁沉积速度相似，然后应拉木细胞壁沉积明显高于正常木。其中茎270um处是应拉木胶质层（G-layer）形成的关键节点，在这个节点向内，半纤维素和木质素的含量会明显下降，因而在这个关键节点上基因表达谱的差异变化会是我们关注的重点。接着将提取的RNA与杨树基因芯片杂交，分析比较应拉木和正常杨树多个不同部位基因表达水平的差异，特别是在胶质层形成节点表达水平的差异。结果表明已知与木质纤维素合成相关的PAL, C4H, F5H、FRA8等基因在胶质层形成节点前上升、胶质层形成节点后下降证明了我们的应拉木芯片结果的可靠性。然后我们将表达水平上升和下降了0.5倍以上的基因全部挑选出来，共筛选到684个杨树基因作为候选基因。接着利用生物信息学比对，我们对候选基因找到它们在拟南芥中所对应的基因。根据拟南芥数据库和我们实验室的拟南芥不同组织表达数据库，筛选在茎部高表达的基因，剔除已经发表的、功能明确的影响纤维素和木质素合成的基因，最后共筛选获得在拟南芥茎中高表达的115个基因。从拟南芥salk研究中心订大约110个基因相对应的T-DNA插入。利用PCR进行鉴定，我们共获得78个纯合体，并观察植物的生长情况。在培养箱中生长8周，切取3cm长度的茎，冻干后，用震荡机打成粉末，利用GC-MS Prolysis仪器，进行细胞壁化学组分差异快速分析。初步分析筛选，我们获得了ERF74、ERF97、bHLH111、UXS3、UGD2等7个可能影响细胞壁中半纤维素和木质素合成或调控木质纤维素合成的基因。利用自身启动子的显性抑制技术，我们发现ERF74、ERF97均能影响植物的生长，植物的叶色加深，目前正在对这些基因进行定位以及功能的进一步分析。最后，我们在杨树中验证了这些基因的表达量，结果表明这些基因的杨树同源基因序列也在茎部表达高表达，用对这些基因在正常杨树和应拉木中的表达分析表明它们在应拉木中高表达。我们设计了杨树中3个ERF等转录因子的显性抑制载体，转化了毛果杨，利用抗性筛选，已经获得了转基因植株；同时我们对UXS3的保守区设计了RNAi载体，也转化了杨树，我们将对转基因杨树做进一步分析。