转录组测序筛选核DNA序列标记重建"螽斯"系统进化史

Katydids correspond to the infraorder Tettigoniidea (Vickery 1979), consisting of Hagloidea, Tettigonioidea, Stenopelmatoidea, Rhaphidophoroidea, etc. The phylogenetic relationships among these taxonomic groups are still not clear. Only few nuclear DNA markers can be used for their phylogenetic relationship studies. The Illumian HiSeq 2000 will be applied for transcriptome sequencing male adults of 5 katydid species and the deep sequencing will produce about 4 Gb transcriptomic data per sample. The orthologous genes will be identifed by comparing with 7 longhorn grasshopper species transcriptome data, including previous sequenced Gampsocleis gratiosa (katydid), Gryllus bimaculatus (cricket) transcriptome data and Lucosta migratoria genome data in public database, and the sequence divergence of the nuclear loci with more than 500 bp in size will be evaluated. New primer pairs will be designed for PCR amplification testing of those nuclear loci which are suitable for deeper-level phylogenetic reconstruction across the major groups of katydids and outgroup cricket. To fully resolve katydids deeper-level phylogenetic relationships, 100 effective amplification nuclear DNA markers will be amplified and sequenced in about 50 species from major groups of katydids. This project is the first time based on comparative transcriptomics approach for high-throughput identify new nuclear DNA markers which suitable for katydid deeper-level phylogenetic study. The results can not only solve the katydid deeper-level phylogenetic relationships and infer the origin and evolution of katydid acoustic communication, but also provide a large number of new nuclear DNA markers for Orthoptera phylogenetic relationship studies.

"螽斯"包括原螽、螽斯、驼螽、沙螽等类群,相当于螽次亚目。这些类群间系统进化关系不清，可选用的核DNA序列标记有限。本项目利用Illumina HiSeq 2000测定5种"螽斯"雄性成体转录组，预期每种获得4Gb数据。通过与实验室之前测定的优雅蝈螽转录组、公共数据库相关数据比较，识别种间直系同源基因。计算长度超过500bp核基因种间序列分歧，选出进化速率适宜的核DNA序列标记。设计引物进行PCR验证，选择100个以上扩增效果良好的核DNA序列标记，并对由"螽斯"各类群选出的50个左右代表种扩增测序。采用超矩阵和超树分析策略，构建稳健可靠的"螽斯"高级阶元系统进化关系。采用比较转录组学方法实现核DNA序列标记高通量筛选，并在更多代表种中对这些核DNA序列标记进行扩增测序。研究结果不仅可重建"螽斯"系统进化史，追溯其声通讯起源与进化，而且为直翅目其他类群系统进化研究提供大量核DNA序列标记。

本项研究是迄今为止对螽亚目Ensifera昆虫进行的最为详尽的系统发育分析。我们利用Illumina HiSeq 2500 高通量测序平台完成了优雅蝈螽两性成体生殖腺及非生殖腺部分转录组和另外20种螽亚目昆虫雄性成体转录组的测定和分析，包括螽斯总科Tettigonioidea 14种（涵盖我国分布的9亚科中的8个），原螽总科Hagloidea 1种，驼螽总科Rhaphidophoroidea 1种，沙螽总科Stenopelmatoidea 1种，蟋蟀总科Grylloidea 2种，蝼蛄总科Gryllotalpoidea 1种。各个转录组的初始下机数据量（Raw data）7.00–11.99Gb，经质控后得到高质量Clean data量4.93-7.62 Gb。20种螽斯转录组的fastq数据已上传至NCBI的SRA数据库（序列号为SRR5796866-SRR5796885）。对各种昆虫转录组数据组装、注释和生物信息学分析，从OrthoDB9（http://www.orthodb.org）数据库中挑选10种昆虫作为参考物种。按照直系同源基因在这10个物种中都是单拷贝的标准，我们共得到包含1621个直系同源基因的数据集，并基于这些直系同源基因序列构建了螽亚目6总科21种系统进化树。同时，我们新测定32种螽亚目昆虫线粒体基因组。在三锥迟螽Lipotactes tripyrga中发现一种新的基因排列方式trnR-trnSAGN-trnAtrnN-trnG-nad3。结合NCBI数据库中已公开数据，构建了59种螽亚目昆虫系统进化树（覆盖全部现生总科）。结果支持将螽亚目分为grylloid和 non-grylloid两个分支。支持螽斯总科、原螽总科、驼螽总科、沙螽总科、蟋蟀总科和蝼蛄总科单系性，以及蟋蟀总科和蝼蛄总科的姊妹群关系。螽斯总科被划分为露螽科Phaneropteridae和螽斯科Tettigoniidae。通过比较基于转录组、线粒体基因组数据构建的系统进化树及几种关于螽亚目系统进化关系的假设，我们发现驼螽总科在基于转录组数据构建的系统进化树上的位置非常特殊。后续有待于增加样本量进行深入研究。发表学术论文13篇，其中SCI论文8篇，中文核心期刊论文5篇；1名博士和11名硕士研究生（毕业8人，另外3人将于2019年6月毕业）参与了本项目研究。