tRNA质核转运调控在卤虫休眠形成及对极端环境适应与进化中的分子机制

Artemia, a small crustacean which live in salt lakes on plateaus, has attracted much attention for its special reproduction pattern and surprising stress tolerance. To cope with harsh and complex habitats such as salt lakes, Artemia are able, when the circumstances become adverse, to release their offspring into a dormant, encysted cysts in order to ensure survival. The metabolisms and the cell cycle of the diapause cysts was completed shut down and had the ability to resume development in appropriate conditions. Clearify the molecular mechanism underlying the diapause initiation and termination was important for the understanding of adaptation and evolution of orgnisms in harsh conditions. Our previously studies showed that in the process of the initiation of the diapause cysts, a tRNA binding protein, tRBP, was accumulated and retented the pre-mautre tRNAs in the nclears of Artemia cells. In this study we will first characterize the gene expression, variation and distribution of tRBP. Based on the screening of the substrates of tRBP protein, we will focus the target molecules and signal pathways related in tRBP and tRNA nuclear-cytoplasm trafficking regulation during the initiation and termination of diapause. Clarify of molecular mechanism of diapause formation and principal of Artemia evolution will give us a valuable insight into the special process and form of organism of Artemia diapause embryo during the environmental evolvement of the earth.

在各种极端环境下卤虫经过长期的适应进化形成了可产生新陈代谢完全停止，细胞周期和胚胎发育完全停滞的休眠胚胎，并成为高山盐湖和海洋极端高盐环境特有物种。休眠胚胎在适宜环境条件下将终止休眠并重新启动细胞分裂和胚胎发育过程并发育形成新的个体。阐明这种特殊的生命过程所涉及的分子机制对于研究生物在极端环境下的适应与进化具有重要的理论意义。我们的前期研究表明卤虫休眠胚胎形成过程中tRNA及相关蛋白从细胞质向细胞核中转运并积累，本项目将针对卤虫休眠过程中控制tRNA质核转运的tRNA结合蛋白的基因表达的基本特征，蛋白质水平的变动规律及在细胞核质中的分布特征展开研究。结合生物信息学分析确定与tRNA质核转运调控相关的目标分子和相应的信号通路，阐明蛋白在卤虫休眠胚胎形成过程中参与调控的分子途径和作用机制。此外，结合卤虫休眠胚胎形成的特殊生命过程及分子进化途径，探索卤虫对极端环境适应与进化的分子机制。

为适应恶劣的生存环境，卤虫进化出了一套独特的生殖方式，在环境适宜的条件下直接产下无节幼体，也在环境恶化时产下包被坚硬外壳的休眠卵。休眠卵可以长期维持静止状态。休眠卵长期维持静息状态的具体机制尚需进一步阐释。本研究发现，在卤虫卵生途径发育末期，一种RNA结合蛋白(命名为tRBP蛋白)的表达量显著增加，暗示这种蛋白可能对卤虫休眠卵的形成具有重要作用。通过筛选卤虫休眠卵的cDNA文库获得了表达该蛋白的全长基因，通过比对发现这种RNA结合蛋白含有一个La蛋白结构域和两个RNA识别结构域。将该基因转染到真核细胞中发现该蛋白明显定位于细胞核内。分离卤虫休眠卵的核质蛋白进行Western blotting分析发现，在卤虫休眠卵的形成过程中，tRBP蛋白在细胞核内的累积非常明显。通过免疫共沉淀和凝胶阻滞实验我们确定了这种RNA结合蛋白的作用底物，结果显示，tRBP可以与tRNA 尤其是前体tRNA 特异性结合。而在激活的卤虫休眠卵细胞中tRBP 没有与tRNA形成复合体，表明tRBP与tRNA的结合与维持休眠卵细胞周期的停滞相关。进一步通过原位杂交发现，在表达有tRBP-GFP 融合蛋白的Hela 细胞中，tRNA前体在核内大量累积，而Northern blotting分析也表明，表达有tRBP-GFP融合蛋白的Hela细胞中，前体tRNA与成熟tRNA的比例高于只表达GFP蛋白的对照组。在卤虫休眠卵细胞的形成过程中，成熟tRNA的比例也显著减少。结果表明，tRBP在细胞核内的出现导致了前体tRNA累积在核内，控制了tRNA在核质间的转运。通过流式细胞技术分析，发现表达有tRBP-GFP融合蛋白的Hela细胞与对照组细胞相比更倾向于停滞在G1/S期，而卤虫的休眠卵细胞也大部分处于G1期。通过BrdU实验表明，大部分表达有tRBP-GFP融合蛋白的HeLa细胞不能通过S期。通过腺病毒携带的tRBP蛋白可以抑制小鼠肿瘤模型中肿瘤的生长。在微注射了tRBP-GFP基因的爪蟾和斑马鱼的卵母细胞幼体发育过程中也得到了相同的结论。最后，我们检测了tRBP蛋白调控细胞周期停滞的信号通路，对细胞周期的调控提出了一个新的模型，本研究为阐述细胞静息机制提供了新的思路和数据。