缺氧诱导朊蛋白在胃癌中的高表达及可能机制

朊蛋白（PrPc）是朊病毒在细胞内的正常形式，功能尚不清楚。在国科金的资助下，本课题组在国际上率先发现PrPc与胃癌恶性表型相关。但是，为什么应该高表达在神经系统的PrPc在胃癌中高表达？神经系统的研究发现PrPc在脑组织缺氧区域表达增高，发挥抗氧化、保护神经元功能。而缺氧是胃癌等实体肿瘤的常见现象，胃癌中朊蛋白的高表达是否也与缺氧有关？本课题组前期实验提示缺氧可以诱导胃癌细胞中PrPc表达增高，且与MERK/Erk通路相关。本项目将在上述工作的基础上，进一步通过实体组织标本证实缺氧诱导胃癌组织中PrPc表达的变化，利用高通量的方法筛选其中的效应分子及信号转导通路，最后通过干预手段研究缺氧诱导PrPc表达变化后对胃癌恶性表型的影响。该项目是本课题组既往对PrPc与胃癌相关研究的深入，有助于进一步揭示PrPc的生物学功能，明确PrPc在胃癌发生发展中的分子机理，对于理解胃癌发生具有重要意义。

缺氧孵箱或CoCl2进行缺氧诱导后，通过Western Blotting和RT-PCR方法检测发现胃癌细胞系SGC7901、AGS、MKN28中PrPc的 mRNA和蛋白表达水平均增加。免疫荧光检测不同缺氧时间诱导朊蛋白的表达，提示缺氧诱导朊蛋白表达呈慢性增高趋势，8h时达到最高峰，24h后接近常氧表达量。生物信息学及前期报道提示缺氧可以诱导含有HSE启动子区域的朊蛋白转录活性增强，为了研究本实验中缺氧诱导朊蛋白表达改变的机制，我们设计了含有HSE的朊蛋白启动子载体和不含有HSE朊蛋白启动子载体，分别给予缺氧和常氧诱导后，用双荧光报告系统检测其转录活性。 MKN28细胞共转染pGL3-PRNP (-756~+96) 或PGL3-PRNP (-2253~+289)后，孵育24h再给予缺氧处理，发现缺氧诱导后朊蛋白启动子活性比常氧时启动子活性增强(p<0.05)，缺氧处理时含有HSE的朊蛋白启动子pGL3-PRNP (-2253~+289)转录激活活性是不含有HSE的朊蛋白启动子pGL3-PRNP (-756~+96)及空载体pGL3对照的4.3倍。2D和基因芯片筛选缺氧及常氧条件下转染PrPc细胞系差异表分子，进一步Western Blot及RT-PCR验证发现，缺氧条件下朊蛋白的高表达可以被MERK/ERK特性应抑制剂PD98059减弱，但是p38 MAPK特异性抑制剂SB203580和JNK特异性抑制剂SP600125对缺氧引起的朊蛋白表达增高没有影响。最后，研究发现缺氧诱导PrPc-siRNA转染的胃癌细胞可以增加ADR、VCR、VP-16、5-FU和CDDP等化疗药物的敏感性，说明缺氧诱导PrPc高表达后影响胃癌细胞的恶性表型。