酿酒酵母中TRAPP复合体共有亚基Bet5和Trs20参与细胞自噬的功能研究

Autophagy is a pathway that is involved in intracellular substances degradation within eukaryotic cells. Autophagy plays important roles in the physiological processes of cell growth, development, and biological resistance. In Saccharomyces cerevisiae, there are three types of TRAPP complex (Transport Protein Particle complex), TRAPPI, II and III, consisted of different subunits. By studying the roles of specific subunits of TRAPPII and TRAPPIII, it is found that TRAPPII and TRAPPIII activate the small GTPases regulation autophagy. To our knowledge, there are still no reports on whether TRAPP common subunits, which are the components of TRAPPI, make sense in regulating autophagy. Our preliminary results showed that mutation in TRAPP common subunits Bet5 and Trs20 blocked autophagy with phenotypes different from those resulted from mutations in TRAPPII and TRAPPIII specific subunits. In this study, we are going to utilize genetic, biochemical, and molecular biology techniques to elucidate the regulatory mechanism of Bet5 and Trs20 in autophagy, so that the mechanism of TRAPPI in autophagy could be elucidated. These results will fulfill a comprehensive understanding of the TRAPPs' roles and their regulation mechanisms in autophagy.

细胞自噬是真核细胞内一种降解胞内物质的途径，在生物体生长发育及抗逆等生理过程中起重要作用。酿酒酵母中有三种类型的TRAPP复合体（Transport Protein Particle complex），TRAPPI、II和III，由多个亚基按不同组合组成。研究TRAPPII和TRAPPIII专一性亚基的作用，发现TRAPPII和TRAPPIII均通过激活小G蛋白活性调控细胞自噬，但目前没有关于TRAPP共有亚基所组成的TRAPPI是否调控细胞自噬的报道。我们的结果显示TRAPP共有亚基Bet5和Trs20突变使自噬过程受阻，但不同于TRAPPII和TRAPPIII专一性亚基突变所造成的自噬缺陷表型。本研究拟采用遗传、生化及分子生物学等手段阐述Bet5和Trs20调控细胞自噬的机制，借此反映TRAPPI在细胞自噬过程中的调控机制。研究结果有利于全面认识TRAPP在细胞自噬中的作用及调控机制。

研究内容：细胞自噬是维持真核细胞生理平衡并帮助细胞度过逆境的一种高度保守的细胞内物质降解途径，在生物体生长发育及抗逆等生理过程中起重要作用。细胞自噬具有复杂的调控网络，其中TRAPP复合体（Transport Protein Particle complex）发挥了重要的作用而被广泛研究。以前的研究表明酿酒酵母中至少存在四种类型的TRAPP 复合体－TRAPP I、II 、III 和IV。其中，TRAPP II作为鸟嘌呤核苷酸交换因子（Guanine nucleotide Exchange Factor, GEF）激活小G蛋白Ypt31/32调控细胞自噬，而TRAPP III和IV作为GEF激活小G蛋白Ypt1调控细胞自噬。先前的研究主要针对4种复合体的专一性亚基，而对4种复合体所共有的亚基研究较少。目前的研究表明，4种TRAPP复合体都含有5个共有亚基－Trs20、Trs23、Trs31、Bet3和Bet5，本研究选取3个共有亚基Trs20、Bet3和Bet5进行研究，发现这些亚基均参与了细胞自噬过程。通过荧光观察自噬蛋白Atg8，发现Atg8错误定位在细胞内的内质网表面，不能定位于细胞自噬装配起始位点（Phonehagophore Assembly Site, PAS）。前人研究结果表明，Atg8定位于PAS调控自噬的生成。在本研究中开展的生化实验证明bet3ts中没有自噬体的存在，说明TRAPP复合体共有亚基Bet3功能作用于自噬体形成之前。本研究通过观察Atg9在三个共有亚基突变体中的定位，发现Atg9在细胞内能正常循环运输。因此，Atg8在三个突变体中不能定位于PAS并不依赖于Atg9，这项研究与前人对TRAPP复合体专一性亚基的研究有所不同，因为所有的专一性亚基被认为影响Atg8的运输均依赖于Atg9。进一步，在trs20ts、bet3ts和bet5ts突变体中过量表达小G蛋白Ypt1，突变体中的自噬缺陷表型被恢复，而过量表达Ypt31则不能。这些结果表明，TRAPP复合体共有亚基Trs20、Bet3和Bet5是通过Ypt1参与细胞自噬的调控。 这一研究结果为全面认识TRAPP复合体在细胞自噬中的作用及调控机制奠定了基础。.完成情况：完成合同考核指标，发表文章4篇（均标注），其中3篇SCI论文，1篇核心期刊论文。协助培养硕士2人，均获得了学位、毕业工作。