同源三倍体水稻基因组DNA甲基化研究

多倍化是植物进化的重要方式，多倍化后DNA甲基化修饰变异调控多倍体基因表达，进而影响进化的历程。过去对多倍体甲基化研究多针对个别基因，没有多倍体全基因组DNA甲基化修饰图谱的报道，无法在基因组水平上详细分析DNA甲基化对多倍体基因表达与进化的影响。本项目拟采用来自水稻双胚苗中遗传背景相同，仅具倍性差异的同源三倍体与对应二倍体为材料，按DNA甲基免疫沉淀与tiling芯片杂交相结合的技术方案(ChIPchip)，建立水稻同源三倍体全基因组高分辨率甲基化变异图谱。在基因组水平上，详细分析多倍化后DNA甲基化修饰变化；分析DNA甲基化对多倍体染色质结构的影响；结合已有编码基因和小RNA表达资料，探讨多倍体DNA甲基化对基因表达的调控机理，并通过亚硫酸盐测序和实时PCR进行验证。项目研究结果将为植物多倍体进化中表观遗传调控机制的揭示奠定基础。

以遗传背景相同的同源三倍体（3N)与二倍体(2N)水稻为材料，采用medip测序技术，建立水稻同源三倍体全基因组高分辨率甲基化变异图谱，结合已有编码基因和小RNA表达资料，探讨多倍体DNA甲基化对基因表达的调控机理，并通过亚硫酸盐测序和实时PCR进行验证。结果发现：第一，3N与2N在全基因组水平上的甲基化变异图谱差异不大，3N甲基化率为32.97%，2N为32.45%。第二，倍性水平的变化对基因元件的甲基化模式没有影响，即甲基化主要集中在TSS上游1500bp-0以及TES下游0-1500bp处，且promoter区的甲基化程度相对高于gene body区。第三，针对倍性变化后甲基化变化呈加性效应的基因，进行功能归类，发现随着倍性的增加，甲基化上升的基因显著参与离子转运、光反应、细胞离子平衡等功能；甲基化水平下降的基因则参与依赖于RNA的DNA复制、胚乳发育调控、组蛋白甲基化、核小体组装等功能。第四，siRNA只聚集在发生DNA甲基化的区域，随着倍性的增加，rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA等的含量存在减弱的趋势；miRNA在2N中的表达水平最高，倍性间差异表达的miRNAs，其靶基因主要变化为：甲基化水平降低（占76.85%），基因表达水平下降（占61.34%）。以上结果表明，水稻在倍性增加的过程中，基因组的甲基化模式相对稳定，甲基化程度略微增加，small RNA的调控作用下降，但是总RNA的表达水平的变化多呈非加性效应。推测水稻基因组的倍性调控，不仅仅是简单的剂量效应，而是一个复杂的调控过程，究其表观遗传机制而言，小RNA的调控减弱和基因组甲基化增加，可能是一种方式。项目成果对于水稻等禾本科作物多倍体进化中基因表达和表观遗传调控研究奠定了基础。