硒敏感硒蛋白对糖尿病肾病中系膜细胞的作用及机制

Mesangial cells(MCs) are primary targets in the development of Diabetic Nephropathy(DN), these cells undergo apoptosis or acquire an activated phenotype and proliferation with excessive production of matrix proteins, which relate to oxide stress. This project focus on effect of selenium-regulated selenoprotein on mesangial cells. Firstly, we intend to collect whole blood and plasma of different stages of DN patients and healthy controls and compare the selenium contents, while detect the activity of selenoproteinase and oxide stress levels. Then in cultured selenium dificiency huaman MCs line MES-13, administrate with different concentrations of sodium selenite and detect the cells pathological changes to describe the selenoprotein transcriptome and selenium-regulated selenoproteins by RT-qPCR and Western blotting. Next step, the role of selenium-regulated selenoproteins is verified on MCs through ①overexpress and RNAi the selected selenium-regulated selenoproteins on MES-13 cells ②administrate with different concentrations of high glucose to induce oxide stress on MES-13 cells and detect the cells pathological changes ③detect the selenium-regulated selenoproteins in the kidney of DN patients by hybridization in situ and immunohistochemical. Finally we explore its mechanisms by studying the splice variants of selenium-regulated selenoproteins. We may find new mechanism of renal MCs pathological changes and provide new targets for drug development in DN.

在糖尿病肾病（DN）的发生发展中系膜细胞（MCs）是主要受到攻击的目标，表现为凋亡、表型转分化及细胞外基质合成增多等病理反应，其作用机制与氧化应激密切相关，硒蛋白通过调控氧化应激对MCs的作用及机制尚无报道。本课题首先通过检测不同分期DN患者血浆和全血中硒含量、氧化应激水平及硒蛋白酶活性，明确低硒与DN的关系；再通过建立人肾小球MCs系低硒培养模型，在不同浓度硒刺激下用实时定量PCR获得MCs病理变化时的硒蛋白表达谱，并用免疫印迹法筛选出硒敏感的关键硒蛋白；最后通过①在人肾小球MCs系过表达和RNAi硒敏感硒蛋白②促氧化应激因子高糖刺激人MCs并检测硒敏感硒蛋白③在DN患者肾脏组织中原位杂交和免疫组化法检测硒敏感硒蛋白来验证硒敏感的关键硒蛋白对MCs的作用，并通过对硒敏感硒蛋白不同剪接体的研究初步探索其作用机制。以期为DN中MCs病理变化机制提供新的补充，为DN的药物开发提供新的靶点。

干预和控制人肾小球系膜细胞MCs氧化应激是延缓慢性肾脏病发生发展中的关键问题，硒蛋白通过调控氧化应激对MCs的作用及机制国内外尚无报道。本课题拟阐明慢性肾脏病尤其是糖尿病肾病中硒元素含量、硒敏感硒蛋白在其疾病发展中的作用及机制。.按照研究计划我们完成了：1）本课题收集了419例慢性肾脏病(CKD)患者及正常对照的全血和血浆，包括86例糖尿病肾病(DN)检测了包括硒在内8项微量元素的含量。发现随着疾病进展，患者血浆中的硒含量进一步下降，尤其是在血液净化病人中；2）建立了MCs的低硒、高糖及TGF-β刺激三种培养模型，筛选并鉴定出了SelS、Gpx1、SelN三种硒敏感硒蛋白；3）构建了含有所筛选应激相关硒敏感硒蛋白的RNAi干扰序列，转染了正常条件和低硒、高糖及TGF-β三种条件培养下的MCs，检测纤维化相关指标Fibronectin、Collagen I、α-SMA及细胞周期相关指标CyclinD1、P21的表达，初步验证应激相关硒敏感硒蛋白对人MCs纤维化和增殖的影响；在TGF-β刺激下的MCs表达应激相关硒敏感硒蛋白Gpx1基因以及对此基因进行RNAi，通过检测信号通路相关指标，确定了敲低硒敏感硒蛋白GpX1减少TGF-β1所诱导的smad3及Erk1/2磷酸化，初步阐明了应激相关硒敏感硒蛋白对人MCs纤维化和增殖的作用机制。4）通过对应激相关硒敏感硒蛋白SelS、Gpx4及TrxR1的mRNA不同剪接体研究，验证应激相关硒敏感硒蛋白可能通过其截短体来实现促细胞凋亡的功能，是硒敏感硒蛋白的作用机制之一。5）免疫组化法检测了SelS在不同人肾脏病病理切片中的表达，发现硒敏感SelS在以IgA沉积为主的肾脏病中表达显著，其作用机制尚在进一步探索中。.本课题现已总结资料，有3篇有基金标注的论文已发表，1篇有基金标注的论文已接收，4篇有基金标注的论文在评审中，2篇有基金标注的论文在撰写投稿中。