新型佐剂嵌合鞭毛蛋白（CF）在幽门螺旋杆菌多表位疫苗CCU中的佐剂效应及作用机制研究

Vaccine adjuvants, especially biological adjuvant is an important part for vaccine development. Some bacterial flagella can activate TLR5 and then stimulate the bodyto produce mucosal immune response besides specific humoral and cellular immunity, which has become a hotspot in current vaccine adjuvants development. Therefore, a new chimeric flagellin(CF) was constructed by our group through combinating the TLR-5-activating D0&D1 domains of S. typhimurium Flic with D2&D3 domians of Hp FlaA. We gained a new fusion vaccine CCU by inserting the CF to the N-end of Hp accine CTB-UE and preliminary confirmed that CF and CCU could activate TLR5. The adjuvantivity of CF in CCU will be evaluated in vivo by mongolian gerbil Hp infection models. Moreover, the mechanism of CCU against Hp infection will be investigated through assaying the levels and types of antibodies. It will be revealed the immune protection mechanism of CCU through detecting expression of the molecules associated with TLR5（including IκB-α, pJNK , p38MAPK ）、other specific cytokines and supporting by the study of mice genetically deficient in Toll-like receptor 5 (TLR5). This work will contribute to the selection of adjuvant for Hp multi-epitope vaccine in theory and experiment.

疫苗佐剂尤其是生物佐剂是疫苗研发中的重要组成部分。一些细菌鞭毛蛋白可激活TLR5，既能刺激机体产生特异性的体液和细胞免疫，又能调节黏膜免疫反应，成为目前疫苗佐剂研究的热点之一，但是Hp鞭毛蛋白不具备这种能力。因此，本课题组择了能与TLR5结合的沙门菌鞭毛蛋白Flic的D0和D1区结合Hp鞭毛蛋白FlaA的D2，D3区，构建了一种新型嵌合鞭毛蛋白CF，作为佐剂应用于Hp疫苗CTB-UE获得新的融合疫苗CCU，并初步证实CF和CCU都具备刺激TLR5的能力。在此基础上，拟采用蒙古沙鼠Hp感染模型，验证CCU的免疫原性、免疫特异性及治疗Hp感染的效果，评价CF的佐剂效应；通过检测与TLR5相关的下游分子IκB-α、JNK、p38MAPK等表达情况及沙鼠体内细胞因子种类和水平的变化，并结合TLR5免疫缺陷型小鼠模型实验，揭示CF在Hp疫苗中的免疫作用机制，为Hp疫苗佐剂研究提供新的思路和实验依据。

幽门螺杆菌（Hp）是一种革兰氏阴性菌，可以选择性的定植于人的胃黏膜，在胃溃疡、胃癌、黏膜相关淋巴组织性淋巴瘤的发生发展中起重要作用，清除Hp是一种阻止胃炎和相关疾病的通用和有效的方法。随着细菌耐药性的出现，三联疗法也不能达到理想的效果，研制出一种安全高效的抗Hp疫苗是治疗Hp感染的有效方案。目前，Hp疫苗的研究也由传统疫苗向抗原纯度高，特异性强，安全性好的DNA疫苗和亚单位疫苗发展，但分子小，免疫原性相对较差，难以产生有效的免疫应答，需要佐剂来增强其免疫原性或宿主对抗原的保护性应答，疫苗佐剂尤其是生物佐剂是疫苗研发中的重要组成部分。一些细菌鞭毛蛋白可激活TLR5，既能刺激机体产生特异性的体液和细胞免疫，又能调节黏膜免疫反应，成为目前疫苗佐剂研究的热点之一，但是Hp鞭毛蛋白不具备这种能力。因此，本课题组择了能与TLR5结合的沙门菌鞭毛蛋白Flic的D0和D1区结合Hp鞭毛蛋白FlaA的D2，D3区，构建了一种新型嵌合鞭毛蛋白CF，作为佐剂应用于Hp疫苗CTB-UE获得新的融合疫苗CCU（后更名为CCF），通过小鼠鼠Hp感染模型，验证了CCF的免疫原性、免疫特异性及治疗Hp感染的效果，评价CF的佐剂效应，揭示CCF疫苗的免疫作用机制。实验结果证明，CF和CCF可以激活TLR5，调节黏膜免疫反应，增强了疫苗的免疫原性、免疫特性，并提高疫苗防治Hp感染的治疗效果，增强了疫苗减少Hp定植能力，减少胃部炎症。CCF免疫给药组血清中IgG和IgA的水平较CTB-UE免疫组显著提高，并且胃组织中IgA的水平也有显著提高。CCF免疫组IFN-γ、IL-6的水平呈剂量依赖性，而IL-10和IL-17的水平与给药剂量成相反趋势。揭示了CCF主要通过产生高滴度的IgG和IgA抗体的体液免疫应答以及Th1/Th17介导为主的细胞免疫应答的作用机制，发挥抗Hp感染的免疫应答反应。课题以酸耐酶型纳米颗粒HP55/PLGA和 HP55/PBCA为CCF的口服呈递系统，增强了疫苗的特异性免疫应答，使机体获得持久性的免疫力，提高了疫苗的免疫效果。本项目为Hp疫苗佐剂的选择提供了新的思路，为相关疫苗的研发提供了实验基础和理论依据。