橙色大白菜类胡萝卜素积累的分子机理

橙色叶球大白菜的育成开辟了大白菜品质育种新方向，橙色大白菜是由于球叶中积累了不同的类胡萝卜素而呈现出不同颜色的，但其积累类胡萝卜素的机理还不清楚。本研究拟以具有自主知识产权的遗传稳定的橙色大白菜材料为研究对象，通过近等基因系群体的构建，使用SRAP、AFLP等分子标记对橙色基因进行精细定位，结合白菜基因组测序结果，通过染色体步移获得该候选基因，并通过生物信息学对该候选基因功能进行初步分析；同时通过同源序列法克隆橙色大白菜和白色大白菜球叶中类胡萝卜素代谢途径关键酶基因和Or基因（花椰菜橙色基因），对其进行序列比对、表达分析，同步分析两者之间类胡萝卜素组分含量，通过比较橙色候选基因与类胡萝卜素代谢关键酶基因及Or基因之间的关系，筛选控制类胡萝卜素积累的关键性基因。一方面将丰富植物类胡萝卜素代谢调控理论，更重要的是为有目的性的人工创造类胡萝卜素含量高的保健型大白菜新种质提供技术支撑和理论指导。

橙色大白菜由于富含类胡萝卜素而具有重要的营养价值，本研究以纯合橙色叶球大白菜和白菜叶球大白菜杂交、杂合单株连续自交获得1724 个单株的F2S4群体为试材，开展了橙色基因的连锁遗传图谱、图位克隆及功能验证，类胡萝卜素成分分析、类胡萝卜素积累相关酶基因的表达分析、转录组比较分析；类胡萝卜素提取方法的优化；橙色大白菜功能标记设计；橙色叶球抗氧化能力和硝酸盐含量测定等研究。取得了主要结果是：1 构建了橙色基因的精细遗传图谱，离Br-or最近的两侧标记的遗传距离分别为0.2 和0.1 cM，将目的基因Br-or基因精细定位于基因组16.7kb区间；2第一个将该ORF1 (Bra031539)确定为候选基因，克隆了基因全长；3 发现了橙色大白菜Br-or基因启动子区域88bp的缺失、3’末端501 bp的插入以及2个SNPs；4 构建了过表达普通大白菜BrCRTISO cDNA全长，橙色大白菜Brcrtiso cDNA全长及包含2个SNP 但是不含有3’端大片段插入的橙色大白菜Brcrtiso cDNA（35S-Brcrtiso）的3个过量表达载体，对拟南芥crtiso突变体进行互补验证，证明只有橙色大白菜Brcrtiso cDNA的阳性转基因植株不能互补Atcrtiso突变体；同时从橙色大白菜BrCRTISO表达分析及启动子GUS分析证明启动子的缺失并导致其功能和BrCRTISO表达的变化，因此确认该基因3’末端有501 bp的插入是导致BrCRTISO功能丧失、产生橙色大白菜的原因；5根据启动子的缺失设计了共显性标记Br-crtiso marker，通过与Br-or 位点共分离确认Bra031539基因为候选基因；6 通过类胡萝卜素成分分析表明橙色大白菜特异积累前番茄红素，这与BrCRTISO的功能丧失结果一致。7从基因表达水平和Western 分析证明了橙色大白菜BrCRTISO基因的突变，并没有对类胡萝卜素生物合成和积累相关基因（PSY, PDS, ZDS, LCYB, LCYE, CHYB, CHYE, ZEP, CCD4 and Orange (Or)）的转录丰度和蛋白水平产生大的影响。8 对橙色和白菜叶球近等基因系成熟球叶转录组测序分析发现了372个基因有显著性差异。本研究明确了橙色大白菜类胡萝卜素积累的分子机理，对进一步创新橙色大白菜具有重要意义。