CXCL12α转录子3'非翻译区突变影响肝细胞癌的分子机制研究

趋化因子CXCL12与肝细胞癌(肝癌)的发生及转移关系密切，目前对CXCL12在肝组织表达调控及其参与肝癌发病的机制尚未阐述。申请者首次在CXCL12α转录子3'非翻译区（3'UTR）发现了"GA"插入突变（GA+）。研究显示GA+突变位于典型的G-四链体结构中，附近含有多个ARE调控元件。该突变在转录水平提高基因表达，其突变频率在肝癌患者中明显升高，提示GA+突变或其附近3'UTR调控元件参与了肝癌的发生。本研究1）软件分析CXCL12α的3'UTR调控元件，报告基因克隆筛选出典型元件序列；2）以RNA表达载体携带该元件分别转染肝细胞及肝癌细胞，研究其对细胞分化与增殖的影响；3）检测肝组织CXCL12α转录子表达及基因组GA+突变，分析GA+突变对组织内CXCL12α表达的影响。以阐述GA+突变影响肝癌发生的分子机制。研究可丰富对肝癌发病的认识，并为临床干预提供新的理论基础和实验依据。

本课题从CXCL12α转录子3'非翻译区（3'UTR）内新发现的"GA"插入突变（GA+）着手，研究内容可分为以下三个部分：.首先，研究GA+突变参与调控CXCL12α表达的可能及机制。 以报告基因载体pGL3克隆并筛选出典型元件序列pGL3-promoter-3’UTR-MU与pGL3-promoter-3’UTR-WT。将重组质粒pGL3-promoter-3’UTR与pRL-CMV载体共转染至Hep2细胞中，经过荧光指数（FI）分析，发现两载体转染的细胞之间FI差异无统计学意义(P=0.297)，但携带3’UTR的载体的FI指数都明显低于质粒空白组 (P=0.000)，提示CXCL12α的3’UTR是基因表达的重要调控区域，但其影响基因表达似与GA (+)突变无关。对72例HCC患者及76例CHB患者的突变检测及分析表明，GA (+) 突变基因频率在HCC组、CHB组与正常组之间无统计学意义。经RT-PCR定量检测CXCL12α在肝组织内表达水平，再按照GA+突变分组后再分析，GA+突变对肝组织内CXCL12α表达的影响也不明显。.其次，检测HCC组织、癌旁组织及不同纤维化程度肝组织内CXCL12α与CXCL12β的表达，分析CXCL12转录子在肝组织内的表达特征。利用RT-PCR及免疫组化方法，发现CXCL12α是肝组织内的优势转录子。在HCC组织中，CXCL12α、CXCL12β的含量明显低于癌旁组织（P=0.000）。检测CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织，发现随着纤维化程度加重CXCL12表达量明显增加。表明CXCL12与其受体CXCR4在肝癌细胞转移及肝纤维化发生过程中发挥的作用尤为明显。.第三，研究CXCL12α在肝纤维化形成中的作用机制。检测不同肝纤维化程度肝组织中CXCL12与其受体CXCR4的表达， CXCR4在肝纤维化星状细胞（HSC）表面表达量明显升高，提示CXCL12与受体CXCR4参与纤维化形成。CXCR4在S3期肝纤维化组织的成纤维细胞聚集部位，以及增生的胆小管和血管上皮表达增强。且CXCR4表达有被IL-1诱导趋势，利用肝星状细胞系LX-2与原代培养肝星状细胞，分别加入IL-1与CXCL12α诱导，可见CXCR4表达明显增强，细胞的移行能力明显增强。结果说明CXCL12α可以通过诱导HSC表面的CXCR4表达，促进肝纤维化形成。