溶藻弧菌菌落相变关键基因cdgC的功能和调控机制研究

溶藻弧菌是人和养殖动物的病原菌。菌落相变（colony Phase Variation）是病原菌适应环境和感染宿主的一个重要机制。申请人在前期工作中首次观察到溶藻弧菌菌落由粗糙/浑浊型向光滑/透明型菌落转化的相变现象，发现这两种菌落不仅具有不同的毒力和抗胁迫能力，而且它们的运动性、生物膜形成和密度感应调控体系相关基因的表达有显著差异，转座子突变分析发现合成细菌第二信使环二鸟苷（cdi-GMP）的基因cdgC可能是调控菌落相变的关键基因之一。本项目将在此基础上，分别在这两种菌落中构建cdgC基因的缺失突变株系，分析基因突变后对细菌鞭毛合成、多糖合成、密度感应体系及其相关基因表达的影响。从而阐明该基因的调控网络及其对溶藻弧菌菌落相变的调控机制,为发展新的防治方法提供理论基础.

构建、筛选和鉴定并获得cdgC基因的突变菌株2株；构建了该基因回补株2株；初步鉴定突变株与野生株的鞭毛合成、生物膜形成能力和胁迫能力存在显著差异；对相关基因的表达进行了定量分析;分析了野生菌株和突变菌株的主要表型差异，包括细胞形态、运动能力、生物膜能力、抗胁迫能力等进行了分析。发现基因突变后生物膜形成能力有较显著降低，但鞭毛和菌落形态等无显著变化，运动能力也没有发生变化，然而，我们比较了野生菌株和突变菌株对72种碳源和24种化合物及培养条件，发现了突变菌株对部分理化条件适应能力发生较大的变化，对抗生素等的适应能力有较大变化。为了从分子机理上了解相变的机制，我们在原有计划基础上增加分析了两个野生菌株的转录组，并比较了转录组差异，发现了138个基因表达差异，其中cdgC基因及其他cdGMP调控基因也发生了显著变化，显示溶藻弧菌菌落相变是一个复杂的过程，cdgC和cdGMP信号参与对相变的控制，是其调控网络的重要组成部分。研究比较了溶藻弧菌rpoX基因突变株和野生型株的表型及生理差异。结果显示，rpoX基因不影响溶藻弧菌的基本生长，对溶藻弧菌的菌落相变也无影响。研究比较了溶藻弧菌rpoS基因突变株、rpoS与rpoX双基因突变株及野生型株的表型及生理差异。结果显示，rpoS基因或双基因缺失均不影响溶藻弧菌的基本生长；rpoS对溶藻弧菌的菌落相变亦无影响。研究比较溶藻弧菌hfq基因突变株与野生型株的表型及生理差异。结果显示hfq基因缺失使溶藻弧菌细胞潜伏期延长，但并不影响对数期细胞的分裂生长；hfq负调控溶藻弧菌的相变过程，hfq缺失导致细菌呈现不透明、粗糙的菌表。动物毒性实验发现，Hfq的缺失导致溶藻弧菌对石斑鱼的毒力丧失。. 因此，实验结果显示cdgC和cdGMP信号是菌落相变调控网络的重要组成部分，但不是决定性因子；hfq是决定菌相及其相关表型的决定性因素。