自噬体形成关键组分ATG12/ATG5/ATG16复合体在水稻氮素再循环利用中的分子机制

Improve the nutrition use efficiency is recognized as a effective measures to reduce the excessive input of fertilizer and maintain high crop yield in agriculture. Autophagy is an evolutionarily conserved degradation system in eukaryotic cells, and played a important role in nitrogen remobilization. Central to autophagy are two conjugation pathways that attach ATG8 to PE and ATG5 to ATG12, which then help with vesicle prolongation and enclosure. Our study showed the over-expression of OsATG8b can enhance the nitrogen use efficiency and nitrogen remobilization efficiency in rice. We generated GFP-OsATG8b transgenic rice and atg12, atg5, atg16 mutant as research material, it elucidate the biochemical function of ATG12/ATG5/ATG16 protein complex in the autophagic process by detecting the expression of ATG8-PE and observing GFP-ATG8 fluorescence for the formation of autophagosomes; meanwhile, 15N pulse chase analysis can be used to estimate nitrogen use efficiency and nitrogen remobilization efficiency. The Project will reveal the molecular mechanism of autophagy involved in nitrogen remobilization, and provide strategic guidance for nitrogen application in rice molecular breeding and cultivation.

提高植物体的氮素再循环利用是减少农业中过度的肥料投入而不影响作物产量的有效措施之一，自噬途径作为真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的过程，在氮素的再循环中发挥了重要作用，其中ATG12和ATG5，ATG8与PE的类泛素化结合途径是自噬过程中的关键步骤，它们对于自噬小泡的延伸和封闭起着重要的作用。我们的前期结果表明超表达自噬体形成标志基因OsATG8b能够提高水稻的氮素利用效率和氮素转移效率。本项目将利用已构建的GFP-OsATG8b转基因水稻和获得的atg12，atg5，atg16突变体为材料，通过检测ATG8-PE的表达和观察GFP-ATG8荧光来分析自噬体的形成，阐明ATG12/ATG5/ATG16复合体在自噬过程中的生化功能，同时通过稳定15N同位素标记等方法，分析氮利用效率和氮转移效率，揭示自噬调控水稻氮循环再利用的分子机制，并为水稻分子育种及耕作中的氮素应用提供策略性指导。

生物体对受损或多余的细胞器、蛋白质、脂类和其他细胞成分的降解并加以循环利用对于维持细胞内稳态和抵御外界胁迫环境起着关键作用。自噬途径作为真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的过程，在氮素的再循环利用过程中发挥了重要作用。其中，ATG12、ATG5和ATG16，ATG8与PE的类泛素化结合途径是自噬过程中的关键步骤，它们对于自噬小泡的延伸和封闭起着重要的作用。我们的研究结果表明OsATG8b是一个组成型表达的基因，能够被氮饥饿和碳饥饿所诱导。酵母互补实验证明了OsATG8b可以恢复酵母atg8突变体的表型，能够运输氨肽酶的前体进入液泡，且在酵母中能够发挥正常的功能，说明OsATG8b具有和酵母ATG8相似的自噬功能。酵母和水稻稳定表达OsATG8b与GFP的融合蛋白结果显示，OsATG8b蛋白主要定位于自噬体上。我们还获得了OsATG8b表达上调的超表达株系和OsATG8b表达下调的干扰株系，通过检测ATG8-PE(代表了正在形成和已经形成的自噬体)的表达量证明OsATG8b超表达株系有较高的自噬活性而OsATG8b干扰株系的自噬活性有轻微的下降。表型分析表明OsATG8b超表达株系的产量明显高于对照，而OsATG8b干扰株系则具有较低的产量和较差的种子品质。15N示踪实验揭示了OsATG8b超表达株系有较高的氮素再循环效率，而OsATG8b干扰株系有着低的氮素再循环效率。除此之外，我们发现在ATG12/ATG5/ATG16复合体中，OsATG12能够跟OsATG5，OsATG12和OsATG16互作。ATG5-CRISPR转基因植株表现出不育的表型。我们利用已有的sGFP-OsATG8b转基因植株，通过GFP-Trap分离得到OsATG8b的互作蛋白103个，我们对其中的CDK5RAP3通过酵母双杂交，双分子荧光互补，CO-IP，pull-down验证了他们是互作的，由于CDK5RAP3与细胞周期是负相关的，而OsATG8b超表达植株产量增加，表明自噬超量降解CDK5RAP3使细胞周期变快，与我们表型相符。