以纳米纤维为支撑的新型多酶催化体系用于生物制备过程的研究

构建和利用包括辅酶再生的多酶体系实现复杂的反应是生化工程领域极具重要性的前瞻课题。本项目提出利用电纺技术制备以纳米纤维为支撑的新型多酶催化体系，并用于生物制备过程，这种多酶催化剂可以最大限度地解决传统颗粒形态催化剂所难以克服的传质阻力、机械强度、酶稳定性之间矛盾。将尝试如下几种多酶催化剂制备方法：1）首先制备纳米纤维，再将酶和辅酶负载在纤维外表面；2）酶和高分子溶液共纺直接将催化剂杂化在纤维内部；3）对含有酶的水相和溶有高分子材料的油相组成的W/O乳液进行电纺，制备含有"纳米微水池"的多酶线型微囊；4）将上述不互溶的油、水两相置于同轴的空腔内，电纺制备包埋有多酶的中空纳米纤维。本项目以甘油脱氢酶、亮氨酸脱氢酶和NAD＋催化合成1,3-二羟基丙酮和叔亮氨酸的多酶体系为例，研究催化剂的结构对反应动力学的影响机理；并充分利用纳米纤维易于分离和成膜的独特优势，探索适合其连续化操作的反应器的构建。

构建和利用包括辅酶再生的多酶体系实现复杂的多步反应是生化工程领域的重要研究课题。本项目利用静电纺丝技术，构建以纳米纤维为支撑的新型高效多酶催化体系。首先以a-胰凝乳蛋白酶（a-chymotrypsin，CT）为模型酶，尝试了如下四种方法制备纳米纤维酶：1）将CT直接吸附在纳米纤维的表面；2）在纤维表面预吸附一层BSA，然后将CT共价交联在纤维表面；3）制备出可溶于有机溶剂中的酶，然后与高分子溶液共纺直接将酶杂化在纤维内部；4）开发新型的同轴共纺技术，将含有酶的水相和不互溶的高分子溶液分别置于同轴喷丝头的内、外相，通过同轴共纺将酶包埋在中空纳米纤维的腔室内。上述四种方法制备出的纳米纤维酶催化性能测试结果表明，同轴共纺制备出的基于中空纳米纤维的催化剂与其他三种纳米纤维酶相比，具有最高的酶活收率和稳定性，其催化水解反应的米氏常数Km值与游离酶完全一样，Kcat为游离酶的90%；在有机相中的催化活性为游离酶的500多倍，在无水甲醇中的半衰期达到2h以上。.在此基础上，构建了基于中空纳米纤维的多酶体系，利用同轴共纺技术直接将用于胆汁酸医学检测的多酶体系，包括3a-类固醇脱氢酶(3a- hydroxysteroid dehydrogenase，3a-HSD)，黄递酶和辅酶NADH包埋在中空纳米纤维的腔室内。通过改变同轴共纺过程中内、外相电纺液的流速，制备出不同结构的中空纳米纤维，系统研究了纤维结构对酶催化性能的影响，在最佳条件下酶活收率可以达到80%。中空纳米纤维多酶体系成功应用于胆汁酸的检测，线性检测范围达到200uM。与游离酶相比，多酶体系在4oC和25oC下的半衰期分别提高了14.5倍和147倍。此外，本课题还借助Autodock分子模拟软件，以及双偏振干涉仪(Dual Polarization Interferometry，DPI)和表面等立体共振检测仪(Surface Plasmon Resonance, SPR) 等最先进的光学仪器，对氧化还原酶与辅酶之间的特异性结合过程进行了深入研究，为构建高效的多酶体系提供理论基础。.本课题的相关研究成果已经在Analytical Chem.、Langmuir、Bioresource Technol.等本领域的顶级学术期刊上发表论文18篇，其中SCI收录12篇；申请专利5项，授权专利4项；培养博士生3名，硕士生5名。