维生素D调控足细胞巢蛋白Nestin表达，改善足细胞形态与功能的研究

慢性肾脏病（CKD）患者中维生素D缺乏很常见，而活性维生素D或其类似物能显著降低CKD患者的蛋白尿，改善肾功能，同时促进足细胞形态恢复，但其作用机制并不清楚。足细胞形态的正常是保证其功能的前提。我们前期的研究于国内外率先报道中间丝蛋白巢蛋白（Nestin）特异性表达于成熟足细胞，是调节足细胞特殊形态和屏障功能的重要因素。最近我们通过比对基因序列发现在Nestin 上游-2.3kb和-4.6kb处可能存在两个维生素D的反应元件（VDREs）。本研究拟通过嘌呤霉素氨基核苷（PAN）肾病大鼠模型和体外足细胞培养，构建病毒载体下调Nestin和维生素D受体（VDR）基因表达，点突变技术构建含荧光素酶的Nestin报告基因等方法，探讨维生素D在调控Nestin基因表达，进而影响足细胞形态和功能中的可能作用，为活性维生素D在减少蛋白尿，延缓CKD进展中的应用提供新的理论依据。

本课题计划围绕维生素D在调控巢蛋白Nestin基因表达，进而影响足细胞形态和功能中的可能作用开展如下工作：（1）建立嘌呤霉素氨基核苷（PAN）肾病综合征动物模型，体内观察活性维生素D对大鼠足细胞Nestin表达及损伤修复的影响；（2）体外培养足细胞，下调Nestin和VDR基因表达，观察PAN诱导的足细胞损伤；（3）制作包含VDR的反应元件（VDRE）的Nestin基因报告质粒，转染足细胞，给予PAN和/或活性维生素D干预，体外验证VDR-VDRE在调控Nestin基因转录中的作用。.经过3年的科学研究工作，申请人及相关团队已初步完成了研究计划中的第一及第二部分，证实了维生素D 受体活化剂（VDRA）—帕里骨化醇可以明显改善PAN引起的蛋白尿、低蛋白血症及高脂血症，促进足突融合的恢复，这可能和帕里骨化醇可以纠正PAN引起VDR、nephrin、nestin表达的异常有关。体外研究中也证实帕里骨化醇可以纠正PAN导致的VDR、nestin、F-actin、α-actinin-4、podocin表达或排列的异常，使受损足细胞形态恢复正常。但在免疫荧光及蛋白质免疫共沉淀研究中，并未发现Nestin与VDR在蛋白水平有直接的相互作用，活性维生素D通过何种途径影响Nestin的表达或结构，有待于进一步开展，是否通过调控基因表达，蛋白合成，还是通过其它间接途径实现VDR与Nestin的通话，值得探讨。而第三部分，也是本课题的关键部分，由于多次尝试，尚未成功制作出包含VDR的反应元件（VDRE）的Nestin基因报告质粒，仍在进行中。