K+-Cl-协同转运蛋白2在创伤性脑损伤中增强GABA抑制效应的作用及其机制

Traumatic brain injury (TBI) contributes significantly to the mortality and morbidity of traumatized patients, which is an urgent clinical problem. Excitatory amino acid played a critical role in elucidating the complex pathogenesis of TBI. GABA (gamma-aminobutyric acid) is the main inhibitory transmitter in the adult brain. It blocks the diffusion and conduction of neuronal excitotoxicity through activation of anion (predominantly Cl-)-permeant GABA receptors. Under pathological challenges, GABA, which are normally hyperpolarizing, can become depolarizing. The loss of GABA-mediated hyperpolarizing can contribute to neuronal hyperexcitable injury. KCC2 is critically involved in the mediate of GABA effect. Under pathological conditions such as epilepsy and cerebral ischemia, KCC2 was found to inhibit a marked excitatory shift of GABA. A preliminary study demonstrated that GABA switch from inhibition to excitatory was paralleled by a decline of KCC2, however, the exact mechanism is still under investigation. In the present study, a time-dependent regulation of KCC2 will be investigated via RT-PCR、western blot and immunofluorescence after TBI in rat model. The neuroprotection of the KCC2 after TBI will be indicated via KCC2 antagonist and over-expression KCC2 lentivirus. In addition, we will discuss the role of KCC2-mediated GABA receptor activity in mechanism of KCC2 neuroprotection via KCC2 SiRNA and GABA receptor antagonist. This suggests KCC2 may be important as a novel therapeutic target for TBI.

创伤性脑损伤（TBI）发病率高，预后差, 是急需解决的临床问题。兴奋性氨基酸神经毒性作用是其核心病理环节。GABA是脑内最主要抑制性递质，与GABA受体结合从而阻断神经元兴奋性毒性的扩散。病理状况下，GABA抑制性效应可向兴奋性转化，加重神经元损伤。KCC2是调节GABA效应最关键分子，既往研究发现，KCC2在癫痫，脑缺血等疾病中可抑制GABA向兴奋性转化。我们前期研究发现，TBI后KCC2表达降低，同时GABA抑制性向兴奋性转化，但其机制尚不清楚。本研究制作大鼠TBI模型，采用RT- PCR、western blot、免疫荧光检测TBI后KCC2动态表达，应用KCC2抑制剂和过表达KCC2慢病毒载体探讨KCC2活性改变对TBI的作用；并进行皮层神经元培养，应用KCC2 siRNA、GABA受体阻断剂来探讨KCC2-GABA 活性转变在KCC2保护作用中的机制，从而为TBI治疗提供新思路。

创伤性脑损伤(TBI)是神经外科的常见病、多发病，具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点。对TBI病理机制研究发现：它是一多种细胞和分子通路参与的脑继发性损伤造成的神经元损伤，其中兴奋性氨基酸的过度释放被认为是各种损伤机制的起始因素。GABA是中枢神经系统最主要的内源性抑制性神经递质，其介导的内源性抑制性神经传递作用依赖于细胞内的低氯环境，病理状态下，低氯可转变为高氯环境，使GABA的抑制性作用减弱甚至转变为兴奋性，造成脑内的兴奋性和抑制性失衡，诱发兴奋毒性损伤作用。因此，我们设想，控制氯离子的浓度，可以防止GABA向兴奋性转化，从而对TBI起到治疗效果。.近年来的研究表明：KCC2是神经元细胞氯离子浓度梯度的关键调节因子，也是成熟神经元GABA抑制作用的关键调节因素。我们之前研究发现，脑损伤后大鼠损伤区KCC2蛋白和mRNA表达量明显下降，继而GABA的超极化抑制作用转变为去极化兴奋作用。因此，我们推测KCC2通过调节氯离子浓度，抑制GABA向兴奋性转化，从而参与了脑外伤病理生理过程。本研究课题是在申请者前期研究的基础上提出，研究KCC2在对抗TBI继发的兴奋性损伤的作用及其所涉及的分子调控机制。.研究发现，TBI后损伤侧皮层脑组织中的KCC2蛋白量以及mRNA 水平呈动态降低趋势，大脑皮层BDNF、p-ERK表达也明显降低，而激活态的caspase-3表达水平明显增加，同时神经元凋亡、脑水肿及神经功能缺损明显加重；应用外源性褪黑素干预后大脑皮层BDNF、p-ERK和KCC2的表达明显升高，神经元凋亡减少，脑水肿减轻，同时神经功能得到改善。在离体实验模型中，通过应用KCC2激动剂及抑制剂同样证实了KCC2通过抑制神经元凋亡在TBI损伤中发挥重要调节作用。.基于上述结果，我们认为TBI后损伤侧皮层脑组织中神经元特异的KCC2蛋白及mRNA表达水平持续降低，提示其可能参与了TBI后继发性损伤的病理过程。进一步研究发现，KCC2表达下调可能促进了TBI后神经元凋亡。褪黑素能促进BDNF的表达及ERK的激活，进而上调KCC2的表达，从而缓解TBI后caspase-3激活及神经元凋亡，并减轻脑水肿及改善TBI后的神经功能缺失。