CYP1A1与CYP1A2的催化差异性行为及其机制研究

Cytochrome P4501A enzymes (CYP1A) play important roles in metabolic disposition and bio-activation of xenobiotics. Uncovering the substrate preference of each CYP1A isoforms and the key factors affecting their catalytic efficiency, as well as the related mechanism, are very helpful for rational design of highly specific ligands for each CYP1A isoform and those drugs bio-activated by CYP1A. On the basis of our previous works, this project aimed to construct a molecular bank which contains many structural diversity CYP substrates with different skeleton, and then the catalytic behaviors of various substrates were systematic investigated to find the effects of structural modifications on the substrate selectivity and the kinetic behavior in CYP1A. And then, with the aid of computer calculation and molecular biology approach, this project will simulate the interactions between CYP1A1/1A2 and their preferred substrates, to find and validate the key amino acids which play important roles in substrate binding and catalysis, and reveal the differences in substrate binding and catalysis between CYP1A1 and CYP1A2. Ultimately, this project will uncover the key factors affecting the substrate selectivity and catalytic behavior and the underlying mechanism, which provide theoretical basis and research cases for rational design highly specific ligands of CYP1A isoforms.

CYP1A在异源物的处置及代谢活化中发挥了重要作用。揭示CYP1A各亚型的底物偏好性及影响其催化效率的关键因素和机制对于CYP1A亚型特异性配体的理性设计和CYP1A代谢活化药物的研发意义重大。本项目拟在前期工作基础上，构建母核和结构多样性的系列底物库并系统开展不同类型底物在CYP1A1和1A2中的催化行为研究，进而从小分子层面揭示底物修饰位点/取代基团上的差异对CYP1A催化选择性及酶动力学行为的影响规律。在此基础上，借助计算和分子生物学手段模拟CYP1A1/1A2与其偏好底物间的相互作用，寻找并验证在CYP1A底物结合与催化过程中发挥关键作用的氨基酸残基，并从大分子-底物相互作用层面揭示CYP1A1/1A2在底物结合/催化过程中的异同性。最终揭示影响CYP1A1/1A2底物偏好性和催化行为的关键因素和分子机制，并为CYP1A亚型特异性配体的理性设计等研究提供理论依据和研究示范。

本项目依照项目计划书各项研究内容及研究目标开展。在国家自然科学基金面上基金项目（81773810）的资助下，项目负责人杨凌及其所属科研团队围绕CYP1A亚酶在催化选择性上面对不同底物的差异性进行了相对系统的研究，并取得了一系列丰富的研究成果：已完成六十余种结构多样性底物的CYP代谢表型筛选，初步获得底物结构-CYP酶催化选择性规律，初步揭示底物结构修饰对CYP1A亚酶催化选择性的影响规律及潜在机制；系统开展了中药黄芩中的黄酮类成分在 CYP 酶（包括 CYP 1A1 及 1A2）中的催化行为研究，进而揭示催化位点烷基的大小，底物其它区域的结构修饰对 CYP1A1/CYP1A2 催化选择性的影响；完成了羟氯喹（HCQ）CYP代谢表型研究，分析羟氯喹及其代谢物，鉴定羟氯喹在HLM中的代谢转换关系；借助NCMN和NBCeN探针反应对十余种香豆素类化合物抑制CYP1A1和CYP1A2活性也进行了定量考察，发现合成香豆素类衍生物结构与CYP1A1和CYP1A2抑制有偏好倾向性；完成了哆嗦茶碱CYP1A选择性代谢研究，哆嗦茶碱（DOXO）的肝微粒体代谢种属差异，发现DOXO在人，小鼠（MLM），SD大鼠（RLM），新西兰兔（RaLM）和食蟹猴（CyLM）肝微粒体中的代谢产物种类相同，但代谢转化速率不同；完成麦冬主要成分麦冬高异黄酮A (MOA)对P450酶的抑制及灭活作用研究，发现MOA对CYP1A、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1和3A均有抑制作用。酶抑制动力学研究显示MOA是CYP1A、CYP2C8、CYP2C9和CYP2C19的竞争性抑制剂；MOA对CYP3A介导的睾酮6ꞵ-羟化反应是非竞争性抑制；已经发现汉黄芩素调控AhR介导CYP1A家族表达，CYP1A亚型特异性底物多索茶碱，CYP1A抑制剂蛇床子素、花椒毒素、欧前胡索、芫花素、吴茱萸次碱、白芷素等中药单体成分等，可为 CYP1A 亚型特异性配体（如底物或抑制剂）的理性设计、以及 CYP1A 亚型代谢活化前体药物的设计研发提供理论依据和研究基础。已发表 SCI 收录论文6篇，在药代及相关交叉学科领域的高水平国际刊物上发表高水平研究论文3篇；申报发明专利 2 项；应邀在国内外学术会议上进行口头报告5次；培养在读博硕士研究生7人。