油菜KCS底物特异性分析及脂肪酸改良应用研究

长链多不饱和脂肪酸是一种极具营养价值的油脂，被誉为"脑黄金"。但其只在深海鱼类中可以提取，随着人们生活水平提高，对于多不饱和脂肪酸的需求愈来愈大，如何通过油菜来获得长链多不饱和脂肪酸是一个热点和难点。油菜中超长链脂肪酸的合成由KCS家族控制，不同组织部位的KCS酶有不同的底物及产物特异性，本项目拟通过分离油菜中不同组织KCS基因家族，利用体外表达系统分析各成员的底物和产物特异性，筛选出可以利用多不饱和脂肪酸的KCS家族成员；同时通过种子中异位表达来进一步确定其是否可以改良脂肪酸组成，为油菜的脂肪酸改良提供自主知识产权的符合生物安全要求的基因源。

KCS基因家族编码β-酮脂酰CoA合成酶，催化超长链脂肪酸延伸过程的缩合反应，是超长链脂肪酸合成的限速酶。通过克隆KCS基因，可阐明KCS基因在超长链脂肪酸及蜡质合成中的功能，为油菜脂肪酸改良提供新的基因源。.通过基因组步移克隆了17个基因的编码序列。对分离的BnKCS基因成员进行亲缘关系分析，从甘蓝型油菜中分离的BnKCS基因成员可分为6个亚类。用KCS基因家族的保守结构域FAE1-CUT1-RPPA检索甘蓝型油菜的全基因组序列，检索到了40条KCS基因序列。推测，甘蓝型油菜中KCS基因家族可能至少有46个成员。.用实时荧光的方法分析甘蓝型油菜中BnKCS基因在不同组织中的表达量。各BnKCS基因在甘蓝型油菜不同组织或器官中具有不同的表达模式，暗示各个基因在不同的组织或器官行使功能。所分析的18个BnKCS基因都在油菜花器官中表达，10个BnKCS基因在茎中表达，13个基因在叶中表达，9个基因在种子中有表达，8个基因在角果皮中表达。5个基因在花器官中特异表达，其中2个只在花粉中特异性表达，1个基因仅在花瓣中特异表达。.将克隆的17个BnKCS在酵母中进行异源表达分析。15个BnKCS基因在酵母中正常表达并翻译蛋白，2个受密码子偏好的影响在酵母中没有表达产物。分析酵母脂肪酸组成发现，只有转BnKCS1基因和FAE1基因的酵母中有超长链脂肪酸的合成，其它转基因酵母均没有新的超长链脂肪酸合成。结果表明这些BnKCS基因不能利用酵母中的脂肪酸作为催化底物。在后续研究中需要在酵母体外添加超长链脂肪酸做底物，进一步研究BnKCS基因的功能。.为了揭示KCS基因与蜡质合成的相关性，鉴定出了7个有突变体纯系的拟南芥kcs突变体。基因表达谱分析显示，突变体中的靶标基因因T-DNA的插入而沉默。用扫描电镜扫描拟南芥突变体及野生型角果和茎表面的蜡质晶体密度，突变体与野生型相比，茎和角果表面的蜡质晶体密度没有明显变化。