液泡ATP酶辅助亚单位Ac45在破骨细胞酸化及骨吸收中的分子机制研究

Vacuolar-type H+-ATPases (V-ATPases) mediated extracellular acidification is crucial for bone demineralization during osteoclastic bone resorption. The importance of this proton pump is demonstrated by many genetic studies implicating them in osteoclast-related diseases such as osteopetrosis and osteoporosis. Our previous studies demonstrated that accessory subunit Ac45 interacts strongly with subunit a3 and the proteolipid c ring, both of which are critical for osteoclast acidification and bone resorption. Using gene overexpression system and siRNA-based approach, we showed that mutantion or targeted suppression of Ac45 impairs intracellular acidification and endocytosis, both are prerequisite for osteoclastic bone resorptive function in vitro. Interestingly, we find that knockdown of Ac45 also attenuates osteoclastogenesis owing to a reduced fusion capacity of osteoclastic precursor cells. In an effort to gain more detailed insights into the functional role of Ac45 in osteoclasts, we generated osteoclast-specific Ac45 conditional knockout mice using a Cre-LoxP system. The osteoclast specific Ac45 conditional knockout demonstrated severe ostepetosis. Thus, we propose that the conditional Ac45 mice will enable us to understand the molecular mechanisms of Ac45 during osteoclast bone resorption and bone remodeling, which may further direct clinical gene therapy in osteoclast related diseases.

酸分泌是破骨细胞骨质吸收的关键环节，通过液泡ATP酶介导的氢离子主动跨膜转运实现。酸分泌异常与骨硬化症、骨质疏松症、骨关节炎、Paget骨病、肿瘤骨转移等多种临床常见病相关。为深入分析破骨细胞酸分泌的分子生物学机制，我们前期通过基因突变、沉默等技术，体外研究阐明了液泡ATP酶亚单位Ac45在破骨细胞缝合区形成、细胞分化、细胞融合、酸化和骨吸收过程中重要的生物学功能。为进一步深入研究Ac45在破骨细胞酸化和骨吸收过程中的分子生物学机制，本研究构建了破骨细胞特异性的Ac45基因敲除小鼠，表型非常显著，将通过系统研究基因敲除小鼠的骨骼系统表型、破骨细胞酸化和骨吸收功能、溶酶体功能、液泡ATP酶蛋白复合体稳定性和各蛋白蛋白相互作用关系，进一步明确Ac45在破骨细胞液泡ATP酶介导的骨吸收过程中的分子作用机制，阐明Ac45在液泡ATP酶中的结构和功能特征，为临床靶向治疗破骨细胞相关疾病提供新的治疗。

破骨细胞是人体内唯一能够吸收骨质的细胞，在骨质疏松症、人工假体松动、骨关节炎及肿瘤骨转移等多种骨溶解疾病中发挥重要作用。在破骨细胞行驶骨吸收的过程中，破骨细胞通过液泡ATP酶复合体（V-ATPase）分泌氢离子来溶解无机矿物质。因此，介导破骨细胞酸分泌的V-ATPase在破骨细胞中发挥重要作用。在人体中，V-ATPase的a3亚基发生突变后，可导致破骨细胞酸分泌功能障碍，从而导致患者发生骨硬化。.V-ATPase是一个复杂的蛋白复合体，其中，Ac45亚基在V-ATPase中的功能尚未明确。在本研究中，我们利用cre-loxp系统，构建了Ac45 flox小鼠，在此基础上，将Ac45 floxed小鼠与Cathepsin K cre小鼠杂交，获得了在破骨细胞内特异性敲除Ac45的条件性基因敲除小鼠。进一步分析小鼠骨骼表型，我们发现Ac45条件性基因敲除小鼠呈现典型的骨硬化表型，组织学分析提示小鼠骨量增多，骨小梁数量增多，骨小梁之间间隙变小，伴随破骨细胞数量增多。体外细胞培养发现，Ac45基因敲除不影响破骨细胞分化功能，但是，破骨细胞骨吸收功能明显障碍。破骨细胞内酸化试验提示Ac45基因敲除后，显著抑制破骨细胞内酸化功能，于此同时，通过分离野生型和基因敲除型破骨细胞的microsome，也证实了Ac45调控溶酶体内酸分泌功能。透射电镜研究破骨细胞的结构，进一步发现Ac45基因敲除后，破骨细胞皱褶缘结构混乱，影响了破骨细胞的骨吸收功能。在此基础上，我们进一步证明了Ac45与V-ATPase的a3和c"亚基之间发生蛋白蛋白相互作用，Ac45敲除后可影响V0结构域蛋白的稳定性，提示Ac45通过影响a3，c“等V0结构域蛋白稳定性，影响破骨细胞酸化功能，导致其骨吸收功能下降，最终导致小鼠骨硬化表型。.此外，我们进一步研究发现，Ac45基因翻译成蛋白后，先形成proAc45蛋白，然后由furin基因剪切Ac45形成成熟的蛋白。为此，我们进一步构建破骨细胞特异性的furin基因敲除小鼠，发现furin敲除后，Ac45不能成熟，酸化和骨吸收功能明显障碍，导致小鼠骨硬化。于此同时，应用furin特异性抑制剂CMK也同样抑制了Ac45的成熟，酸化和骨吸收功能。.总之，通过本项目研究，明确了Ac45在破骨细胞酸分泌和骨吸收中的分子机制，为临床治疗骨溶解疾病提供了新的治疗靶点。