自噬途径在人支气管上皮细胞恶性转化中的作用及其机制研究

吸烟、大气污染和职业暴露是人类发生肺癌的主要危险因素，我们前期研究已证实苯并(a)芘和金属毒物镍(NiS)的暴露是发生肺癌的重要病因，并建立了其诱导人支气管上皮细胞(16HBE)发生恶性转化的动态模型，但具体的致癌机制仍未明了。预实验发现支气管上皮细胞恶性转化后其自噬水平下降，mTOR 激酶活性上升，Beclin 1表达下降，提示自噬可能通过多条途径参与了肺细胞癌变的过程。本项目拟利用前期建立的细胞恶性转化模型，主要采用激光共聚焦扫描显微镜成像和荧光共振能量转移(FRET)技术，在无损伤状态下，实时观测活细胞中 LC3蛋白的荧光强度及定位，监测 mTOR 激酶的激活途径，检测 Beclin 1、和Bcl-xL的相互作用，探讨自噬相关信号通路在 16HBE 细胞恶性转化中的作用机制，并在人群肺癌组织标本中进行验证。从全新的角度阐明肺癌的发病机制，以期建立一个快速有效的肺癌早期诊断方法。

自噬在多种人类肿瘤中均存在活性的改变，正确调控自噬途径可能成为预防和治疗肿瘤的新方法。本项目开展所得的一些结果以及对于一些科学问题的发现对从全新的角度阐明肺癌的发病机具有很好的解析作用。本项目用结晶型 NiS 和反式-BPDE 恶性转化 16HBE 细胞建立了两种肺癌研究模型，并通过在活细胞中转染 GFP-LC3 质粒实时检测发现16HBE 细胞恶性转化后细胞自噬水平均有所下降，直接证明了自噬参与了肺细胞癌变的过程； 通过进一步检测 mTOR，Beclin 1，AKT，AMPK，c-Jun，Bcl-xL，Class ⅢPI3K等蛋白的磷酸化及表达水平，确定了自噬通路关键蛋白的调控机制；采用激光共聚焦扫描显微镜成像及荧光共振能量转移(FRET)技术实时监测活细胞中 AKT 激酶的活性，发现结晶型 NiS 和反式-BPDE 恶性转化 16HBE 细胞中的 AKT 激酶活化速度比未转化的 16 HBE 细胞中的快，进一步确定了自噬途径启动的调控机制；最后，采用 QT-PCR 的方法定量检测了Beclin 1，c-Jun，Bcl-xL ，Class ⅢPI3K等四种基因的 mRNA 表达，明确了自噬通路关键蛋白在转录水平的调控机制。本项目初步确定 Beclin 1， c-Jun，Bcl-xL三种蛋白可能作为肺癌早期检测的指标，这为高危人群的筛选和肺癌预防提供了科学依据。