1p/19q染色体杂合性缺失的胶质瘤细胞系-合成致死药物筛选模型的创建

Oligodendrogliomas are rare primary malignant brain tumors, and 50-70% of these tumors harbor a 1p/19q chromosomal deletion. Recent studies suggest this aberration arises from an imbalanced reciprocal translocation, t(1;19)(q10;p10). Patients with this co-deletion respond better to chemotherapy and/or radiotherapy and have longer recurrence free survival, but the mechanism remains unknown. The development of isogenic cell lines for this disease will prove a critical tool for elucidating the mechanism(s). However, construction of such cell lines has been technically challenging, in part because it is difficult to model the 1p/19q whole-chromosome arm losses. In this application, we propose to create a panel of glioma cell lines with a Cre/loxP-inducible (1;19)(q10;p10) translocation. LoxP sites with flanking antibiotic and fluorescent protein selection genes will be inserted into the 1p and 19q chromosome arms using established recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV) gene targeting techniques. Then，these inducible cell lines will be characterized sequentially by fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH) and cDNA microarray gene profiling studies, in order to confirm that they accurately model the 1p/19q co-deletion seen in primary oligodendroglioma tumors. Finally, we will validate our novel inducible cell lines in a pilot synthetic lethal drug screen for inhibitors of 1p/19q co-deleted glioma cells.

少突胶质细胞瘤是一类较少见的颅内原发性恶性肿瘤,其中50-70%含有1p/19q染色体的杂合性缺失。近年研究表明此染色体的异常源于t(1;19)(q10;p10)的不平衡易位。该染色体缺失与病人对化疗的敏感性和化疗后的不复发生存时间延长呈明显正相关，但产生其有利效果的原因尚不清楚。模拟少突胶质细胞瘤1p/19q 全染色体臂的缺失建立细胞模型是一种理想的研究其保护机制和进行药物筛选的手段。但因其技术性挑战较大，目前世界上尚没有具备1p/19q染色体杂合性缺失特征的胶质细胞瘤的等基因细胞系。本研究将通过rAAV基因靶向技术与Cre/loxP系统诱导建立一系列有(1;19)(q10;p10)染色体易位的胶质细胞瘤细胞系。然后用FISH,CGH,cDNA 微阵列等方法验证所创建的模型的正确性。最后，用一个初步的合成致死药物筛选发现1p/19q染色体杂合性缺失胶质瘤细胞的抑制物以证实此模型的可用性。

本项目原拟通过rAAV基因靶向技术与Cre/loxP系统诱导建立一系列有(1;19)(q10;p10)染色体易位的胶质细胞瘤细胞系。但在实验进展的实际过程中发现通过rAAV基因靶向技术与Cre/loxP系统诱导建立一系列有(1;19)(q10;p10)染色体易位的胶质细胞瘤细胞系技术难度较大，有鉴于自2013年以来，作为第三代基因编辑技术的CRISPR/Cas9系统得到越来越多的重视与应用，该系统的文献多次发表在Nature等高影响因子期刊上，且Torres等人于2014年发表文献，报道CRISPR/Cas9系统成功致使靶染色体双链断裂，产生易位，为我们的研究提供了借鉴。经反复实验验证及与相关技术人员多次沟通后，我们对实验内容进行了适当调整。调整后的实验方案依旧旨在建立一系列有(1;19)(q10;p10)染色体易位的胶质细胞瘤细胞系，但将采用CRISPR/Cas9系统取代原计划的rAAV基因靶向技术，细胞系建成后，仍将用FISH,CGH,cDNA微阵列等方法验证其正确性，最后用合成致死药物筛选证实此模型的可行性。本课题组通过设计获取CRISPR/Cas9基因编辑系统，通过质粒转染至单倍体HAP1细胞株中，Puro药筛后提取细胞gDNA，然后使用限制性内切酶TaqαI、GeneArt® Genomic Cleavage Detection Kit分别检测1p和19q两条染色体的靶位点剪切编辑率，并依此确定后续PCR扩增的检验样本量。然后采用无限稀释法将转染并药筛后的细胞种至96孔板，形成单克隆细胞，提取单克隆细胞gDNA，经聚合酶链反应(PCR)与荧光原位杂交(FISH)验证细胞在CRISPR/Cas9系统的编辑下，存在1p/19q靶位片段的缺失，证实在HAP1细胞株成功创建1p/19q染色体缺失。本课题组在拥有单倍体细胞株中成功构建1p/19q染色体缺失的经验与基础后，下一步将通过CRISPR/Cas9系统在多倍体细胞HEK293、人脑星形胶质细胞瘤细胞U373、人脑少突胶质细胞瘤细胞HS683中创建1p/19q染色体的缺失，为下一步的1p/19q染色体缺失机制研究、具有1p/19q染色体缺失胶质瘤的合成致使药物治疗提供实验平台与基础。我们的长远目标在于将在胶质瘤中针对IDH1突变和1p/19q联合性缺失的靶向药物投入到一期临床试验中。