脑胶质瘤特征性靶标BTBD10参与调控病理机制研究

脑胶质瘤是难以治愈的疾病之一，其最大障碍在于肿瘤恶性增殖及侵袭复发。通过前期高覆盖率芯片筛选，克隆到在胶质瘤组织中特异性表达、有自主知识产权的靶基因BTBD10，初步结果证实靶标与胶质瘤增殖侵袭的生物特性相关，本项目拟对靶标进行蛋白表达、定量检测、原位杂交、酵母双杂交、细胞转染、免疫组化等研究及过表达、干扰靶蛋白表达siRNA慢病毒转染对胶质瘤细胞系生长的影响，以期阐明靶标蛋白功能；利用非整合靶蛋白过表达、siRNA慢病毒进行胶质瘤细胞系和动物模型的实验性治疗，为临床诊治提供潜在分子靶标。项目通过体内、外实验恢复抑癌基因功能和抑制重要癌基因活性，探讨siRNA技术及非整合型慢病毒载体联合基因转染的可行性和为实施脑胶质瘤干预靶点治疗提供实验依据。项目建立在大量前期实验结果基础上，具有重要临床应用研究价值，可造福人类。

项目通过芯片筛选到胶质瘤组织中特异表达、有知识产权的靶基因BTBD10的基础与临床研究，利用克隆测序、信息分析、蛋白表达、免疫组化、定量RT-PCR、RNAi干扰、慢病毒等技术手段，对BTBD10及BSP、GOLPH3、CHIP、HMGN5等靶标参与胶质瘤增殖侵袭特性和调控途径进行研究，对患者进行规范化、系统性诊疗，对预后和生存期行分析。课题组通过观察BTBD10在胶质瘤细胞系和不同病理级别胶质瘤组织中的表达情况，应用实时荧光定量PCR和Western blot检测BTBD10 mRNA和蛋白的表达水平，构建BTBD10过表达慢病毒载体，将外源性BTBD10转入U251细胞，流式细胞仪检测细胞周期和早期凋亡细胞的比例，MTT绘制生长曲线，实时荧光定量PCR和Western blot测定转染后相关基因表达水平变化，得到以下结论：1、BTBD10在胶质瘤组织中的mRNA和蛋白水平均明显低于正常脑组织，与病理级别呈负相关，提示BTBD10和胶质瘤恶性增殖密切相关；2、成功构建BTBD10过表达慢病毒载体，在U251细胞内获得了高转染效率，显著提高BTBD10的表达；3、BTBD10的过表达下调U251细胞中Akt的磷酸化水平，抑制PI3K/Akt通路的活性，下调CylinD1的表达，从而将胶质瘤细胞阻滞在G0/G1期，抑制细胞增殖，促进凋亡；4、BTBD10是胶质瘤抑癌基因，为选择BTBD10作为胶质瘤治疗靶基因提供了实验依据。.申请项目按预先计划按期执行，基本完成研究内容，获得较好实验结果，解决了研究计划中提出的构建稳定表达融合蛋白表达质粒和高效转染等关键问题，发现研究靶标蛋白BTBD10、CHIP、GOLPH3等参与胶质瘤的信号途径及相互作用蛋白，基本达到预期目标。在本项国家自然科学基金资助下，已在J Neurooncol等杂志发表SCI论文7篇，投稿1篇，发表核心期刊2篇，8篇论著参加全国、全军神经外科学术会议，申请2项基因专利；项目主持人以第1完成人完成的，以本项目为基础的研究成果已获2010中华医学三等奖及2012中国抗癌协会科技二等奖各1项。项目为阐明胶质瘤的病理机制提供分子依据。